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目的制备一种可快速特异性识别β-内酰胺酶SHV家族的磁性纳米复合材料,联合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS）建立一种选择性分离、富集及快速鉴定SHV的检测方法以实现细菌耐药性的快速检测。方法（1）利用溶剂热法合成粒径约为300 nm的Fe3O4纳米颗粒（Nanoparticles,NPs）,并用聚丙烯酸（Polyacrylic acid,PAA）对Fe3O4进行修饰制备Fe3O4-COOH NPs。然后使用正硅酸乙酯（Tetraethyl orthosilicate,TEOS）进行溶胶凝胶反应在Fe3O4-COOH NPs表面包裹SiO2薄膜制备Fe3O4@SiO2。随后以Fe3O4@SiO2为基底,以SHV家族特异性表位VDAGDEQLER（VR-10）为模板分子,以硅烷偶联剂3-氨丙基三乙氧基硅烷[（3-aminopropyl）triethoxysilane,APTES]、脲丙基三乙氧基硅烷（γ-Ureidopropyltriethoxysilane,UPTES）和3-[双（2-羟乙基）氨基]丙烷三乙氧基硅烷[Bis（2-hydroxyethyl）amino propyltriethoxysilane,BHAPTES]为功能单体,在TEOS的交联作用下,通过温和的溶胶-凝胶聚合制备SHV家族特异性的分子印迹材料Fe3O4@SiO2@MIP,并对材料进行表征和吸附性能评价。（2）通过PCR扩增目的基因blaSHV-1、blaSHV-18、blaTEM-1,并结合表达载体pET-28a（+）,然后将重组质粒转化入宿主菌E.coli BL21（DE3）中。重组菌由异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside,IPTG）诱导高表达水溶性耐药蛋白:SHV-1、SHV-18和TEM-1。并将得到的蛋白经Ni2+琼脂糖亲和层析柱纯化和脱盐柱脱盐。利用材料对纯化的蛋白进行等温吸附实验及吸附动力学实验,观察材料的吸附性能。（3）以0.05 mg/mL SHV-1水/丙二醇溶液为处理对象、以Fe3O4@SiO2@MIP为萃取剂、以水为淋洗液、以水/氨水（25～28 wt%）溶液为洗脱液,系统优化影响磁性固相萃取（Magnetic Solid-Phase Extraction,MSPE）效果的萃取剂用量和洗脱液中氨水的体积分数。以非产酶标准菌株E.coli ATCC 25922为处理对象,菌体裂解液与水/丙二醇混合并添加0.05 mg/mL SHV-1或SHV-18,在最优条件下经MSPE处理,取微量洗脱液沉积在靶板上,经MALDI-TOF MS检测SHV-1及SHV-18。用建立的MSPE方法对菌株K.pneumonia HFK 417（经基因测序验证产SHV-1）和标准菌株K.pneumonia ATCC 700603（产SHV-18）产生的SHV进行净化富集,评价本研究建立的MSPE-MALDI-TOF MS方法对SHV的检测性能。结果（1）成功合成了粒径约为320 nm的Fe3O4 NPs,并得到了在水中均匀分散的Fe3O4-COOH NPs,进一步在Fe3O4-COOH NPs表面包裹了一层SiO2薄膜,得到了具有核壳结构的Fe3O4@SiO2,经分子印迹技术得到了SHV家族特异性的分子印迹材料Fe3O4@SiO2@MIP。表征结果显示:透射电镜下观察到Fe3O4@SiO2@MIP呈明显的核壳结构,大小分布均匀,无团聚现象;FT-IR和XPS谱图表明该材料的成功制备;XRD谱图显示该材料具有与Fe3O4相同的晶相,表明MIP的制备过程没有改变Fe3O4原有的晶相结构;磁滞曲线表明该材料具有超顺磁性特征,磁响应性高,可由外加磁场快速分离。吸附等温曲线显示Fe3O4@SiO2@MIP对模板分子的吸附量高达50 mg/g,印迹因子高达7.33;与TEM家族特异性表位VDAGQEQLGR（VDR-10）相比,该材料对模板分子表现出良好的选择性,表明该材料是通过形状匹配和官能团识别对模板的特异性吸附,为其通过表位识别特异性吸附SHV奠定了基础。（2）成功构建了重组质粒并导入了宿主菌中,重组菌经IPTG诱导可得到高表达的水溶性蛋白并成功经纯化得到了3种耐药蛋白水溶液。等温吸附实验结果显示:对比非印迹材料,Fe3O4@SiO2@MIP对SHV-1和SHV-18表现出较高的吸附量,但对TEM-1的吸附量较低,表明该印迹材料对SHV-1和SHV-18具有良好的选择性;吸附动力学评价发现该材料对SHV-1和SHV-18在90 min内即可达到吸附平衡,而对TEM-1在210 min内才能达到吸附平衡且吸附量低,Fe3O4@SiO2@MIP对SHV高的吸附量、良好的选择性和快的吸附速率,为基于该材料的磁性固相萃取技术的建立和MALDI-TOF MS对SHV的特异性检测奠定了基础。（3）MSPE优化结果显示:萃取剂用量为10 mg、氨水体积分数为20%时,质谱检出的SHV-1峰响应最高,得到的质谱图中质谱基线平滑、非特异性蛋白得到了有效去除、SHV-1响应信号显著增强。此外,建立的MSPE-MALDI-TOF MS方法进行实际样品检测后得到的质谱检测结果显示:SHV质谱峰在质谱图中清晰呈现,质谱检出的分子量分别对应SHV-1和SHV-18的理论分子量,从而证实本研究建立的耐药检测方法的准确性和实用性。结论本研究成功制备的MIP可对SHV产生特异性吸附,联合优化的MSPE技术建立了β-内酰胺酶SHV家族特异性质谱检测新方法,经验证本方法可实现耐药机制的直接检测,这可能为细菌耐药性快速检测提供了一种新方法,丰富了磁性纳米材料的医学应用价值。