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中药饮片是中医发挥作用的药效物质基础,保证其“安全、有效、质量可控”至关重要。另一方面,很多中药如杏仁、佛手、巴戟天、岗梅等,不仅可用作药物,还广泛用作食品、保健品,深受大众的青睐。由于受众广泛,其安全质量问题更应该引起高度的重视。中药饮片在种植、加工、销售等过程都有可能受到自然界中广泛存在的产毒真菌的污染,产毒真菌的次级代谢产物真菌毒素严重威胁着人类的生命健康,且中药本身具有来源复杂、品种繁多的特点,导致其受产毒真菌的污染情况也比较复杂,必须进行全面的调查分析。因此,建立一种快速、准确的鉴定中药饮片表面污染产毒真菌的方法,明确中药饮片合适的保存条件,对减少污染是十分有意义的。1目的以杂色曲霉毒素（ST）产生菌、黄曲霉毒素（AFs）产生菌、伏马菌素（FBs）产生菌、赭曲霉毒素（OTA）产生菌为研究对象,建立一种可以同时检测这4类产毒真菌的多重PCR方法,并将此方法应用于15种常用大宗中药饮片、4种食品表面污染真菌的检测,评价多重PCR方法用于产毒真菌预警的可行性。最后以岗梅为例,研究中药饮片合适的贮藏条件（温度、湿度）,为建立岗梅防霉储存规范奠定基础。2方法2.1建立同时检测中药饮片表面污染产毒真菌的多重PCR方法根据ST、AFs、OTA、FBs生物合成途径中关键酶的基因序列及真菌的ITS序列,设计合成引物,用于构建四类产毒真菌的多重PCR反应体系。考察反应体系中不同的PCR引物和PCR扩增条件等对PCR产物特异性、明亮度的影响,筛选出最优的组合;考察不同中药饮片（百合、黄芪、党参、枸杞、麦冬、人参、三七、熟地、苦杏仁、桃仁、佛手、石斛、山药、巴戟天、岗梅）基质对多重PCR方法灵敏度的影响,并且利用人工感染产毒真菌的方法来模拟污染的饮片,考察方法的适用性。2.2多重PCR法检测市售中药饮片及食品样品收集不同医院和药店的中药饮片及不同超市的食品,应用建立的多重PCR方法进行检测,分析饮片受四类真菌毒素（AFs、OTA、FBs、ST）产生菌的污染情况。将方法拓展用于食品污染产毒真菌情况分析。2.3高效液相串联质谱（LC-MS/MS）检测8种真菌毒素对购自不同医院、药店的中药饮片,应用LC-MS/MS法检测FB1、FB2、AFG1、AFG2、AFB1、AFB2、ST和OTA,比较LC-MS/MS所得结果与多重PCR检测所得结果,验证多重PCR检测方法的可靠性。2.4中药饮片表面真菌的分离、纯化及分子鉴定对购自不同医院、药店的中药饮片,利用平板稀释法,进行表面污染真菌的分离、纯化与培养,利用真菌鉴定通用引物ITS1/ITS4,以分离纯化得到菌株的基因组DNA为模板,进行PCR扩增,获得目的片段,测序并进行序列比对,确定菌株种类。进行菌种液体培养,LC-MS/MS检测菌株是否产生真菌毒素。比较分子鉴定所得结果与多重PCR检测所得结果的一致性。2.5运用响应面法优化岗梅的储藏条件运用响应面方法结合中心组合（RSM-CCD）设计,设置不同的温度（Temp,20-40℃）和湿度（Hum,80%-95%）来模拟岗梅的储藏环境,考察温度和湿度对人工接种杂色曲霉菌（Aspergillus versicolor）岗梅中ST累积及岗梅中有效成分的影响,筛选不适合杂色曲霉菌生长的条件,确定岗梅的最佳储藏条件。3结果确定了由4对特异性引物和1对真菌通用引物组成的最佳组合,当5对引物的摩尔比为 AF-1:AFST-1:OTA-1:Wen-2:Fum13=2:1:2:2:2 时,多重 PCR 方法结果准确性高、特异性较好。多重PCR方法检测混合菌株的灵敏度均为103 spores/mL。在PCR体系中加入不同的中药饮片基质后,多重PCR同时检测4种产毒真菌的灵敏度达103-104spores/mL（枸杞除外）。与混合菌株结果比较,中药饮片基质对多重PCR灵敏度影响较小。同时,利用多重PCR法检测了人工感染中药饮片,结果显示当侵染浓度为103-104 spores/mL时,除枸杞外,均出现预期的条带,没有其他条带干扰,说明多重PCR检测方法专属性好。对采购于广州地区7间药店、5间医院的15种中药饮片共113份样品进行了多重PCR检测。结果显示,中药饮片真菌污染率达40.7%,其中,污染最严重是产ST菌,高达18.6%,其次为产AF菌（13.3%）;15种中药饮片中受产毒真菌污染最严重的是百合,污染率为83%,其次为苦杏仁、桃仁等,污染率达60%以上。为验证多重PCR检测方法的可靠性,对上述中药饮片样品中的30份平行采用传统分离鉴定方法进行检查,发现此方法与多重PCR检测方法一致性达87.6%。使用LC-MS/MS对以上样品进行检测,相应样品被检测出的毒素与对应的产毒真菌相一致的达89.2%,多重PCR预警准确率占95.4%,没有预警效果占4.6%。将多重PCR方法用于食品表面产毒真菌的检测,对购自不同超市的4种食品（共33份）样品进行检测,结果显示真菌污染率达48.5%,污染最严重的是产FB菌,高达24.2%。利用传统分离鉴定真菌的方法验证了多重PCR方法准确性,方法预警率达87.5%。考察岗梅最佳储藏条件的研究中,当温度范围在26-34℃,湿度为85-90%时,产生了大量ST,当温度范围在26-37℃,湿度为85-95%时,总皂苷和多糖的含量均显著降低。为了减少岗梅中ST的残留以及化学成分的降解,保证岗梅中药饮片的质量安全,建议岗梅中药饮片保存条件是湿度小于85%,温度低于26℃。4结论本文建立了一种不经分离纯化,直接检测中药饮片、食品表面污染FBs、OTA、AFs、ST产生菌的简单迅速、准确的五重PCR方法,无需对样品表面真菌进行培养和纯化,直接检测样品表面污染产毒真菌,可以显著大大提高检测效率。此方法应用于15种中药饮片和4种食品的检测,基于本实验研究的结果显示真菌污染现象较为普遍,中药饮片中产杂色曲霉菌污染最为严重,食品中伏马菌素产生菌污染最为严重,与前期文献报道一致,需引起关注。产毒真菌和真菌毒素的污染对于中药饮片保藏来说是一个迫切的问题,通过控制存储环境条件来控制菌株的生长及产毒是一个有效且简单的方法,较低的温度和湿度可显著降低杂色曲毒素的含量,而维持有效成分的含量稳定。