研究背景肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是全球癌症相关性死亡的第三大常见原因;令人担忧的是,肝癌的发病率仍在持续增加。在中国,慢性乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）感染是HCC最常见的致病原因。虽然近些年来临床上肝癌的诊断能力在不断的增强、肝癌治疗方面业已取得了长足的进展,但是肝癌患者的整体生存状态及预后情况仍然不尽如人意,造成这一状况的一大原因是由于HCC起病隐匿,多数HCC患者确诊时已经处于疾病的中晚期阶段,从而丧失了手术切除等治疗的最佳时机。肝组织病理学检查是确诊肝癌最可靠的检测手段,但肝穿刺是一种有创检查方法,这限制了其用于肝癌的早期筛查。血清甲胎蛋白（alpha fetoprotein,AFP）和腹部影像学诊断的联合应用是目前诊断肝癌的常用方法,但仅有10%-20%的肝癌患者在疾病早期存在AFP水平的异常升高,而影像学检查技术的检测能力容易受到肿瘤大小、受检者的状态等多种外在因素的干扰,这使得及时、有效的诊断肝癌一直是临床上亟待解决的问题。此外,HCC患者的手术后复发也是造成HCC不良预后的重要原因。肝癌的复发机制尚不十分明确,其过程十分复杂,涉及多个步骤、多个环节以及多种不同的分子机制,有研究报道,各种临床病理因素,如肿瘤分化程度、有无门静脉侵袭等,都会影响患者术后的复发及预后,有着相同临床病理特征的肝癌患者可出现不同的预后状况。因此,寻找更加简便、有效的非侵入性生物标志物,提高肝癌的诊断率,预测肝癌不良预后以及术后早期复发,明确HCC高危患者并对其密切随访及尽早给予干预治疗措施,从而改善HCC患者预后具有重要意义。肝癌的发生、发展是多种因素共同作用的结果,有研究表明表观遗传学的改变与多种肿瘤的发生、侵袭和转移息息相关。DNA甲基化是一种被广泛研究的表观遗传学修饰方式,其通常发生在基因启动子区域的CpG岛,可引发基因的异常表达以及抑制基因的失活等。与其他肿瘤类似,HCC的发生和发展是由复杂的遗传和表观遗传改变驱动的。大量研究表明,肿瘤相关基因的DNA甲基化与HCC的发生、进展和侵袭密切相关。因此,特定基因的异常甲基化或可作为肿瘤早期诊断和预后判断的生物标志物。目前,氧化应激在肿瘤发生、发展中的作用受到了越来越多的关注。氧化应激是体内氧化与抗氧化之间失衡的一种状态,在氧化应激条件下,过量的活性氧自由基超越了抗氧化剂系统的消除能力,进而引起肿瘤相关基因表观遗传学的不稳定性而诱导肿瘤的发生。越来越多的证据表明,氧化应激可能是HCC的重要危险因素,在肝细胞癌的形成和发展过程中发挥重要作用。D型细胞周期蛋白2（cyclin D2,CCND2）是D型细胞周期蛋白家族的成员,可以调节G1/S期的进程。其主要功能是与周期蛋白依赖性激酶（cyclin-dependent-kinase,CDK）4和CDK6形成复合物,该复合物诱导视网膜母细胞瘤磷酸化,从而促进细胞进入S期。值得注意的是除了能够促进细胞增殖外,CCND2还可以促使细胞保持非增殖状态,它的这种交替作用已被多个研究证实。CCND2基因启动子的高甲基化可以下调CCND2的表达,从而使得该基因抑制细胞增殖作用的减弱,并且该基因的高甲基化在肝癌组织中较为常见。有文献报道,CCND2的异常低表达与乳腺癌、前列腺癌,以及胃癌、胰腺癌等消化系统肿瘤的发生发展密切相关。基于以上研究背景,本课题对HCC患者CCND2基因甲基化的表达情况进行了研究,并与血清甲胎蛋白诊断HCC的灵敏性和特异性相比较,探讨基因CCND2甲基化在乙型肝炎病毒相关肝细胞癌诊断中的应用价值;分析HCC患者组中CCND2基因甲基化的表达规律,探讨其在肝细胞癌患者行手术切除术后预后判断中的应用价值;探究HCC患者氧化应激状态,并初步探讨氧化应激与CCND2甲基化之间的关联性。第一部分 血浆及外周血单个核细胞中CCND2基因启动子甲基化在乙型肝炎病毒相关肝细胞癌诊断中的价值研究研究目的1.明确乙型肝炎病毒相关HCC患者血浆及外周血单个核细胞中CCND2基因甲基化状态。2.研究CCND2基因表达水平,并探索其与HCC患者临床病理指标的相关性。3.探讨CCND2基因甲基化在乙型肝炎病毒相关HCC诊断中的临床应用价值。研究方法研究对象为2018年3月—2019年12月间在山东大学齐鲁医院就诊的118例HCC患者、47例乙肝肝硬化（liver cirrhosis,LC）患者、75例慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B,CHB）患者和 35 例健康对照者（healthy controls,HCs）。所有入组的HCC患者均伴有HBV感染。通过实时荧光定量多聚酶链式反应（quantitative real-time polymerase chain reaction,RT-qPCR）检测各组研究对象血浆和PBMCs中CCND2mRNA表达水平,应用甲基化特异性聚合酶链反应（methylation-specific polymerase chain reaction,MSP）的方法测定 CCND2 基因启动子区甲基化状态。结果1.HCC患者的CCND2 mRNA水平明显低于LC患者（P＜0.001）、CHB患者（P＜0.001）和HCs（P＜0.001）。而LC患者、CHB患者和HCs三组研究对象的CCND2 mRNA水平无显著差异（P＞0.05）。此外,HCC患者中TNM分期Ⅲ/Ⅳ组的CCND2 mRNA表达水平明显低于TNM分期Ⅰ/Ⅱ组（Z=-2.174,P=0.030）。HCC患者的CCND2 mRNA表达水平与其他临床病理指标之间无显著的相关性（P＞0.05）。2.CCND2基因启动子甲基化比率在HCC患者组中显著增高（PBMCs中为46.61%,55/118;血浆中为 44.07%,52/118）,明显的高于 LC 患者组（PBMCs中为 1 7.02%,8/47;血浆中为 10.64%,5/47;P＜0.001）、CHB 患者组（PBMCs中为 10.67%,8/75;血浆中为 9.33%,7/75;P＜0.001）和健康对照组（PBMCs中为11.43%,4/35;血浆中为5.71%,2/35;P＜0.001）。CCND2甲基化比率在LC、CHB和HCs之间无显著性差异（P＞0.05）。3.为了明确CCND2基因启动子区异常的甲基化是否会影响CCND2的表达,我们比较了 HCC患者中发生CCND2甲基化组和未发生甲基化组之间CCND2 mRNA水平的差异。HCC组中,甲基化组的CCND2 mRNA水平显著低于非甲基化组（Z=-2.045,P=0.041）。4.HCC患者中,CCND2基因甲基化与血管侵袭和TNM分期具有明显相关性。有血管侵袭的HCC患者的CCND2启动子甲基化比率显著高于无血管侵袭的 HCC 患者（PBMCs 中χ2=6.319,P=0.012;血浆中χ2=7.002,P=0.008）。TNMⅢ/Ⅳ期HCC患者的CCND2甲基化率明显高于TNM Ⅰ/Ⅱ期的HCC患者（PBMCs中χ2=8.181,P=0.004;血浆中χ2=11.013,P=0.001）。此外,随着TNM分期的进展CCND2甲基化率也逐渐增高。5.我们评估了 CCND2基因启动子甲基化状态对肝癌的诊断价值。当用于区分HCC与LC患者时,CCND2启动子甲基化在PBMCs和血浆中的诊断灵敏性分别为46.61%和44.07%,特异性分别为82.98%和89.36%。当用于区分HCC与CHB患者时,CCND2启动子甲基化在PBMCs和血浆中的诊断灵敏性分别为46.61%和 44.07%,特异性分别为 89.33%和 90.67%。此外,我们还评估了 CCND2基因启动子甲基化联合AFP对HCC的诊断效能。区分HCC与LC患者时,CCND2启动子甲基化联合AFP水平的受试者工作特征曲线下面积（area under the receiver operating characteristic curve,,AUC）明显高于单独应用AFP诊断HCC的AUC（PBMCs中0.698 vs 0.540,P＜0.001;血浆中0.694 vs 0.540,P＜0.001）,而且二者联合时的诊断灵敏性明显也明显高于 AFP（PBMCs 中 82.20%vs 57.63%,P＜0.001;血浆中 81.36%vs 57.63%,P＜0.001）。区分HCC与CHB患者时,联合诊断的AUC明显高于单独应用AFP的 AUC（PBMCs 中 0.724 vs 0.571,P＜0.001;血浆中 0.720 vs 0.571,P＜0.001）,此外二者联合诊断时比AFP有更高的诊断灵敏性（PBMCs中82.20%vs 57.63%,P＜0.001;血浆中 81.36%vs 57.63%,P＜0.001）和阴性预测值（PBMCs 中 69.12%vs 48.98%,P=0.010;血浆中 68.12%vs 48.98%,P=0.014）。最后我们还发现,无论是当AFP水平低于20 ng/mL时,还是高于20 ng/mL时,CCND2甲基化组的HCC诊断率均明显高于CCND2非甲基化组（P＜0.001,P=0.018）。结论1.CCND2启动子异常甲基化在HCC患者中更为常见。CCND2甲基化和血清AFP的联合应用提高了 AFP对HCC的诊断价值,提示CCND2甲基化有潜力成为一种可靠的、无创的HCC诊断生物标志物。2.CCND2启动子异常甲基化在TNM晚期和血管侵袭的HCC患者中更常见,提示该基因可能可以用于预测乙型肝炎病毒相关HCC的进展。第二部分 外周血单个核细胞中CCND2基因甲基化在乙型肝炎病毒相关肝细胞癌术后预后判断中的价值研究研究目的1.应用MethyLight方法定量检测乙型肝炎病毒相关HCC中CCND2启动子甲基化水平。2.分析CCND2甲基化水平与CCND2基因表达水平之间的相关性。3.探讨CCND2甲基化在乙型肝炎病毒相关HCC中的临床病理意义,并评估其在肝切除术后肝癌患者的预后判断中的价值。研究方法本研究入组2013年2月至2016年4月在山东大学齐鲁医院就诊的257名受试者,包括166名接受手术切除的HCC患者、61名慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B,CHB）患者和30名健康对照组（healthy controls,HCs）。所有HCC患者均为HBsAg阳性,HCC诊断标准参照2010年更新的美国肝病研究协会发布的《肝细胞癌临床指南》。对HCC患者从手术日期到2019年3月进行随访。定义早期肿瘤复发（early tumor recurrence,ETR）为肝切除术后12个月内复发。应用MethyLight定量检测CCND2基因启动子甲基化水平,应用实时定量PCR检测CCND2 mRNA水平。不同甲基化水平的HCC患者生存时间的比较应用Kaplan-Meier法和log-rank检验方法。多因素分析采用Cox 比例风险模型进行分析,研究影响HCC患者术后总体生存率（overall survival,OS）、无病生存率（disease free survival,DFS）和早期肿瘤复发的预后因素。结果1.CCND2甲基化水平用甲基化参考值的百分比（percentage of methylated reference,PMR）来表示。HCC患者中CCND2甲基化水平（PMR中位数27.26%,四分位数区间14.41-52.76%）明显高于CHB患者（PMR中位数5.33%,四分位数区间2.38-10.33%,P＜0.001）和HCs（PMR中位数4.59%,四分位数区间2.83-6.60%,P＜0.001）。CHB与HCs甲基化水平无明显差异（P＞0.05）。此外,我们发现在HCC患者中,CCND2甲基化水平与其mRNA表达水平呈负相关（Spearman r=-0.46,P＜0.001）。2.为了评估CCND2甲基化的临床病理意义,我们探讨了 CCND2甲基化水平与HCC患者临床病理特征指标的关系。有门静脉侵袭的HCC患者的CCND2甲基化水平（PMR中位39.78%,四分位数区间22.93-70.96%）明显高于没有血管侵犯的HCC患者（PMR中位26.42%,四分位数区间12.54-43.83%,P＜0.01）,发生早期肿瘤复发患者的CCND2甲基化水平（中位数54.71%,四分位数区间24.15-72.70%）高于无早期肿瘤复发患者（中位数22.69%,四分位数区间12.24-39.50%,P＜0.001）,TNM Ⅲ/Ⅳ期患者的CCND2甲基化水平（中位数39.78%,四分位数区间22.93-70.96%）比TNM Ⅰ/Ⅱ期患者（中位数23.00%,四分位数区间11.99-40.34%,P＜0.001）明显增高,肿瘤大小≥ 5 cm的HCC患者的CCND2甲基化水平（中位数30.57%,四分位数区间19.35-55.29%）明显高于肿瘤＜5 cm的患者（中位数21.40%,四分位数区间12.12-43.83%,P=0.013）。3.我们用Kaplan-Meier曲线来检验CCND2甲基化水平与HCC患者预后之间的相关性。我们选择中位PMR值27.26%作为区分HCC患者中CCND2甲基化水平高低的分界点。高甲基化水平组的OS时间明显短于低甲基化水平组（P=0.005）,此外,CCND2甲基化水平高的患者有更差的DFS（P＜0.001）。4.我们使用单因素和多因素分析来确定影响OS和DFS的危险因素。单因素分析发现肿瘤数量、肿瘤大小、门静脉侵袭、TNM分期以及CCND2甲基化水平与HCC患者的术后OS和DFS相关。将上述指标纳入多因素分析,结果显示,TNM 分期（HR 3.520,P=0.034）和高 CCND2 甲基化水平（HR 1.740,P=0.022）为OS的独立危险因素;只有高CCND2甲基化水平（HR 2.184,P＜0.001）是DFS的独立危险因素。5.最后,我们研究了 CCND2甲基化对HCC患者早期肿瘤复发的影响。多因素分析发现高CCND2甲基化水平（OR 2.467,P=0.021）是影响HCC患者早期肿瘤复发的独立危险因素。结论1.CCND2启动子区高甲基化与HCC进展及早期肿瘤复发密切相关,这提示CCND2甲基化在疾病危险分层和监测疾病进展的方面具有临床应用价值。2.CCND2启动子区高甲基化是HCC患者术后总体生存率、无病生存率以及早期肿瘤复发的独立影响因素,这表明CCND2甲基化或可作为判断乙型肝炎病毒相关HCC术后不良预后及早期肿瘤复发的生物学标志物。第三部分 乙型肝炎病毒相关肝细胞癌患者外周血单个核细胞中CCND2基因甲基化与氧化应激关系研究研究目的1.明确乙型肝炎病毒相关HCC患者的氧化应激状态。2.比较CCND2基因甲基化组和CCND2非甲基化组氧化损伤水平。3.探索乙型肝炎病毒相关HCC患者PBMCs中CCND2启动子甲基化状态和氧化应激的关联性。研究方法研究对象为2016年6月至2019年8月在山东大学齐鲁医院就诊的302名受试者,包括166名乙型肝炎病毒相关HCC患者、40例肝硬化（liver cirrhosis,LC）患者、66名慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B,CHB）患者和30名健康对照组（healthy controls,HCs）。HCC诊断标准参照2010年更新的美国肝病研究协会发布的《肝细胞癌临床指南》。通过甲基化特异性聚合酶链反应（methylation-specific polymerase chain reaction,MSP）检测 CCND2 启动子甲基化状态。血浆中氧化参数丙二醛（malondialdehyde,MDA）、黄嘌呤氧化酶（xanthine oxidase,XOD）水平和抗氧化参数谷胱甘肽（glutathione,GSH）、谷胱甘肽S-转移酶（glutathione S-transferase,GST）水平使用酶联免疫吸附剂试验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）进行测定。统计分析应用 SPSS 19.0软件（SPSS,Chicago,IL,USA）和 GraphPad Prism 6.0 软件（San Diego,CA,USA）。使用Mann-Whitney U检验比较连续变量的组间差异。使用卡方检验比较分类变量之间的组间差异。选取研究对象中的36例乙型肝炎病毒相关HCC患者和11例HCs,通过超高液相色谱-质谱（ultrahigh performance liquid chromatography-mass spectrometry,UHPLC-MS）检测血浆中代谢物改变。代谢组学得到的数据通过SIMCA软件（V1 6.0.2,Umea,Sweden）进行处理,分别得到主成分分析（principal component analysis,PCA）、正交偏最小二乘法判别分析（orthogonal partial least squares discrimination analysis,OPLS-DA）。差异代谢物的筛选标准为OPLS-DA模型第一主成分的变 量投影重要度（variable importance for the projection,VIP）＞1,P＜0.05,组间物质定量比值＞2或＜0.5。P＜0.05认为具有统计学意义。结果1.乙型肝炎病毒相关HCC患者组的CCND2启动子甲基化率明显升高,明显高于其他3个研究对象组（P＜0.001）。TNM Ⅲ/Ⅳ期HCC患者的CCND2基因甲基化率明显高于TNM Ⅰ/Ⅱ期HCC患者（62.26%vs 41.59%,P=0.013）。2.HCC患者血浆中的氧化损伤指标MDA和XOD水平显著高于LC患者、CHB 患者和 HCs（HCC vs LC,P＜0.001;HCC vs CHB,P＜0.001;HCC vs HCs,P＜0.001）。然而,HCC患者的血浆抗氧化损伤指标GSH和GST水平显著低于LC患者、CHB患者和HCs（HCC vs LC,P＜0.001;HCC vs CHB,P＜0.001;HCC vs HCs,P＜0.001）。以上数据表明,HCC患者的氧化应激和抗氧化防御存在严重失衡。3.在HCC、LC和CHB患者中,CCND2甲基化组的MDA水平和XOD水平与CCND2非甲基化组相比明显升高。而CCND2甲基化组的GSH水平和GST水平明显低于CCND2非甲基化组。以上结果表明,在各组研究对象中,CCND2甲基化组的氧化损伤指标（MDA和XOD）均较非甲基化组升高,而抗氧化损伤指标（GSH和GST）则明显降低。4.乙肝相关HCC患者血浆与对照血浆相比,共筛选出存在显著变化的差异代谢物248种,在正离子模式下,乙肝相关HCC患者血浆中有90种差异代谢物显著升高,69种差异代谢物明显降低;在负离子模式下,乙肝相关HCC患者血浆中有54种差异代谢物显著升高,35种差异代谢物显著降低。5.乙型肝炎病毒相关HCC患者CCND2启动子甲基化组代谢物的改变和非甲基化组存在明显差异,差异代谢物共有308种。与非甲基化组相比,正离子模式中CCND2启动子甲基化组有81种差异代谢物明显升高,128种差异代谢物显著降低的;负离子模式中甲基化组升高的差异代谢物有61种,降低的差异代谢物有38种。并且我们发现,在CCND2启动子甲基化组花生四烯酸明显低于CCND2启动子非甲基化组,与氧化损伤有关的代谢物吲哚硫酸盐、3,4-二羟基苯甲醛明显高于非甲基化组。6.通过对乙肝相关HCC患者和HCs血浆差异代谢物的比较,匹配到的代谢通路主要涉及精氨酸和脯氨酸代谢、牛磺酸和亚牛磺酸代谢、丙氨酸代谢、精氨酸和鸟氨酸代谢等。将乙肝相关HCC患者CCND2启动子甲基化组和非甲基化组的血浆差异代谢物相比,匹配到的代谢通路主要涉及亚麻油酸代谢、组氨酸代谢、苯丙氨酸代谢、半胱氨酸和甲硫氨酸代谢等。其中亚麻油酸代谢是与乙肝相关HCC患者CCND2启动子甲基化组和非甲基化组之间差异代谢物相关性最显著的代谢通路。结论1.乙型肝炎病毒相关HCC患者的氧化损伤和抗氧化防御存在严重的失衡。2.CCND2启动子甲基化组和非甲基化组相比,氧化损伤程度更明显。3.代谢组学结果显示乙型肝炎病毒相关HCC患者CCND2甲基化组中与氧化相关代谢物明显升高,花生四烯酸等炎症分子前体降低,提示乙型肝炎病毒相关HCC患者CCND2甲基化组的氧化损伤及炎症反应较非甲基化组明显。乙型肝炎病毒相关HCC患者氧化应激或许与CCND2启动子高甲基化有关联性。