研究前言急性髓系白血病（AML）是一种常见的血液系统恶性肿瘤,其特征是髓系前体细胞异常克隆性增殖,细胞分化障碍,凋亡受阻。在过去几十年中,尽管包括蒽环类药物和阿糖胞苷在内的临床标准“3+7”化疗方案已经取得了一定进展,但AML患者的预后仍然较差。白血病耐药和复发始终是AML治疗中比较棘手的问题。因此,探索白血病耐药及复发的相关机制具有重要的科学意义,将为AML的联合靶向治疗提供实验室基础。骨髓微环境（BMM）由可溶性因子和支持组织组成,如骨髓基质细胞（BMSC）、细胞外基质（ECM）等,其为AML细胞提供了生存空间,其中BMSC在疾病复发和耐药中起着重要作用。研究表明,在BMSC共培养条件下,AML细胞中多种基因表达水平显著升高,例如半乳糖凝集素-3、富含半胱氨酸的61和自噬相关的E1连接酶7。然而,BMSC介导的AML耐药机制目前尚未完全阐明。p21活化激酶（PAKs）家族属于丝氨酸/苏氨酸激酶成员,根据其结构同源性和调节功能分为两组:Ⅰ组（PAK1-3）和Ⅱ组（PAK4-6）。上游信号通过结合配偶体激活PAKs,促进效应底物的磷酸化,从而介导相关信号传导,包括:细胞骨架重塑、细胞运动、细胞凋亡、细胞周期、DNA损伤反应、基因表达、转化和侵袭等。PAKs家族在多种肿瘤中过表达:PAK1、PAK2在乳腺癌和肝癌中过表达,促进肿瘤的发生发展;PAK3在神经内分泌肿瘤以及PAK4在多发性骨髓瘤中均为高表达状态,且能促进肿瘤细胞的增殖等。最近研究表明,PAK1对多种致癌信号通路具有关键影响作用,已成为肿瘤的潜在治疗靶点。有报道表明PAK1抑制剂与BCR-ABL1酪氨酸激酶抑制剂对慢性髓性白血病细胞具有协同作用。有研究报道PAK1和受体酪氨酸的联合抑制是儿童急性淋巴细胞白血病的一种有价值的治疗策略。然而,PAK1在BMSC介导的AML耐药中的作用尚未见报道。在本研究中,我们使用公开可用的数据集对AML患者中PAK1的表达情况进行了研究探索,确定了其与临床和分子学特征以及临床预后的相关性。我们发现在大多数AML细胞系中总PAK1和磷酸化（活性）PAK1均高表达。通过基因沉默干扰PAK1表达或小分子抑制剂抑制PAK1活性可以显著增强AML细胞对化疗药物的敏感性。此外,在BMSC共培养条件下,AML细胞中PAK1表达显著上调,同时伴随着ERK1/2信号的激活及细胞耐药性增加,而抑制PAK1可逆转BMSC介导的AML细胞耐药。总的来说,我们的研究证实PAK1通过调控ERK1/2信号通路在BMSC介导的AML耐药中发挥重要作用,这为AML的联合靶向治疗提供了新思路。第一部分急性髓系白血病中PAK1表达与临床特征及预后的相关性研究研究目的利用公共数据库、临床标本及细胞系,从PAK家族中筛选出在AML中具有重要意义的PAK成员;明确PAK1在AML中的表达水平,并进一步分析PAK1表达与患者生存、危险度分层、基因突变等的相关性。研究方法1.下载整合TCGA数据库信息,分析PAKs家族成员在AML中的表达情况及对患者生存的影响。1.1 使用 GEPIA（http://gepia.cancer-pku.cn/）分析TCGA数据库中 173 例 AML患者RNA-seq数据和临床数据,比较AML患者和正常对照者骨髓样本之间PAK1-6基因在mRNA水平上的表达差异。1.2根据PAK1-6的中位表达值将AML患者分为低表达组和高表达组,分析PAK1-6不同表达组之间AML患者的生存差异。2.骨髓标本的收集、提取与检测为检测PAK1在AML患者中的表达水平,共收集了 41例急性髓系白血病患者及共8例健康对照的骨髓标本,其中初诊AML患者标本20例,完全缓解的AML患者标本12例,复发/难治的AML患者标本9例。采用淋巴细胞分离液进行密度梯度离心法,分离出骨髓单个核细胞,用Real-Time PCR法检测AML患者及正常对照者骨髓单个核细胞中PAK1在mRNA水平上的表达情况。3.AML细胞系培养及PAK1表达水平检测人白血病细胞系HL60由IMDM培养液,加入10%FBS、1%青链霉素的完全培养基培养,人白血病细胞系THP1、K562、Kasumi-1、U937、Jurkat、KG1由1640培养液,加入10%FBS、1%青链霉素的完全培养基培养。收集以上白血病细胞,提取总蛋白,应用Western Blot法检测PAK1及磷酸化PAK1在蛋白水平上的表达情况。4.PAK1表达水平与AML患者临床特征的相关性分析下载、筛选并整合TCGA数据库中173例AML患者PAK1的表达量及部分临床特征信息,按照PAK1表达量的中位数,将AML患者分为PAK1高表达组及PAK1低表达组。4.1依次分析PAK1表达量与患者性别、年龄、外周血原始细胞计数、骨髓原始细胞计数、外周血白细胞计数、血红蛋白量及血小板计数等的相关性。4.2根据FAB分型标准,将AML患者分为不同的形态学亚型,分析PAK1表达量与不同FAB亚型的相关性。4.3分析PAK1表达水平与AML患者细胞遗传学异常之间的相关性。5.PAK1表达水平与AML患者的危险度分层的关系根据TCGA数据库提供的AML患者相关信息,根据美国国家综合癌症网络（NCCN）指南对AML患者进行预后危险度分层,将AML患者分为预后良好组、预后中等组及预后不良组。分析PAK1表达量与AML患者不同危险度分层之间的关系。6.PAK1表达水平在伴基因突变的AML患者中对预后的影响应用TCGA数据库信息分析PAK1表达水平在伴有FLT3、IDH1、RAS、NPMc突变等分子遗传学异常的AML患者预后中的意义。将AML患者分为PAK1高表达组和低表达组,在此基础上,结合不同的基因突变状态,包括FLT3、IDH1、RAS和NPMc,将AML患者分别分为四组,分析不同组中AML患者的生存情况。7.统计方法使用SPSS V20.0进行统计分析。使用配对或不配对t检验评估两组之间的统计学差异,使用单向单因素方差分析来确定多个组之间的显著差异。Mann-Whitney U检验用于方差不等的数据。Pearson卡方检验用于比较组间临床特征的差异。生存时间以Kaplan-Meier生存图呈现。Spearman相关性检验用于检验基因表达之间的相关性。P＜0.05时,差异被认为具有统计学意义。研究结果1.AML患者及正常对照骨髓中PAK家族成员表达水平分析TCGA数据库中AML患者PAK家族成员的表达水平,其中PAK1及PAK6在AML患者中的表达均高于正常对照,而其他PAK家族成员的表达在AML患者和正常对照之间没有统计学差异。2.PAK家族成员表达水平对AML患者生存的影响PAK1高表达组中AML患者的总生存时间较PAK1低表达组中AML患者的总生存时间显著缩短,而其他PAK家族成员的表达水平与AML患者的总生存无明显相关性。提示在PAK家族中PAK1可能在AML发生发展中发挥重要作用。3.PAK1在AML患者及正常对照骨髓单个核细胞中的表达水平收集AML患者骨髓标本,Real-Time PCR检测结果显示:与正常对照组相比,PAK1在AML患者中的表达水平明显增高,差异有统计学意义。同时,PAK1在初诊AML患者中的表达水平显著高于完全缓解组,PAK1在难治/复发AML患者中的表达也明显高于完全缓解组。提示PAK1可能与AML发病及耐药密切相关。4.PAK1在AML细胞系中的表达水平收集7种白血病细胞系,其中THP1、Kasumi-1、U937、HL60和KG1为AML细胞系,K562为CML细胞系,Jurkat为T-ALL细胞系。Western Blot检测结果显示,PAK1及磷酸化PAK1（p-PAK1）在大多数AML细胞系中高表达。5.PAK1的表达与AML患者临床特征的关系5.1整合分析TCGA数据库中AML患者的数据,结果显示PAK1高表达与患者高龄,较低的骨髓原始细胞数,较低的血红蛋白量和较高的血小板计数有相关性。5.2数据库中AML患者共有16例M0型,42例M1型,39例M2型,16例M3型,35例M4型,18例M5型,2例M6型,3例M7型,2例未分类。其中M4和M5亚型患者PAK1表达相对较高,M3亚型患者PAK1表达相对较低,差异有统计学意义。5.3在PAK1高表达的患者中,复杂核型更为常见,t（8;21）和t（15;17）细胞遗传学异常较为少见。5.4 COX多因素分析显示,与年龄和细胞遗传风险状态相似,PAK1表达水平可能是AML的预后因素之一。6.PAK1表达水平与AML患者危险度分层的关系分析PAK1表达水平与AML患者不同预后危险度分层的相关性,其中预后良好组32例,预后中等组103例,预后不良组36例,无法分组2例。结果显示,与预后中等组及预后不良组相比,预后良好组患者PAK1表达水平显著降低。7.PAK1表达水平在伴有基因突变的AML患者中对预后的影响在不伴FLT3、IDH1、NPMc或RAS突变的AML患者中,PAK1高表达被证明与较差的预后相关。对于伴FLT3突变的AML患者,PAK1高表达较PAK1低表达的患者预后更差,而且同时具有FLT3突变和PAK1高表达的患者生存时间最短。研究结论1.PAK家族成员中仅PAK1在AML患者中显著高表达且与不良预后密切相关。2.在新诊断和复发难治性AML患者中PAK1表达水平明显高于完全缓解患者。3.PAK1高表达与较高的细胞遗传学风险和复杂的染色体核型密切相关。第二部分急性髓系白血病中PAK1的生物学功能及作用机制研究研究目的阐明PAK1基因对AML细胞增殖、凋亡以及药物敏感性的影响,并进一步探索PAK1发挥作用的下游调控机制。研究方法1.慢病毒感染AML细胞系下调PAK1表达为了研究PAK1在急性髓系白血病中的生物学功能,我们选取了 THP1和Kasumi-1两株AML细胞系,通过携带shRNA的慢病毒转染技术,对THP1和Kasumi-1细胞中的PAK1基因进行了稳定下调。1.1将含有PAK1 shRNA的慢病毒感染AML细胞系,根据GFP绿色荧光标记进行流式荧光分选,分选的细胞继续扩大培养,得到PAK1表达水平稳定下调的细胞株。1.2通过荧光显微镜和流式荧光分析评估PAK1下调组（ShPAK1）及对照组（ShCtrl）细胞的转染效率。1.3 Real-time RT-PCR 及 Western blot 方法检测 THP1 和 Kasumi-1 细胞中PAK1的下调效率。2.慢病毒下调PAK1表达后AML细胞增殖检测通过慢病毒转染及筛选,我们构建了 PAK1稳定下调的细胞株,使用CCK-8检测试剂盒,检测在不同时间段,PAK1下调组及对照组中AML细胞增殖能力的变化。3.慢病毒下调PAK1表达后AML细胞凋亡检测慢病毒下调AML细胞中PAK1的表达后,应用Annexin V/PI或Annexin V-FITC/7-ADD双染细胞凋亡检测试剂盒,流式细胞仪检测PAK1下调组及对照组细胞的凋亡率。4.慢病毒下调PAK1表达后AML细胞药物敏感性检测4.1用慢病毒下调THP1细胞中PAK1的表达后,分别用不同浓度的Ara-C（2μM、4 μM）或 IDA（10 μg/L,20 μg/L）处理 24 h,应用 Annexin V-FITC/7-ADD双染与流式细胞术检测PAK1下调组（ShPAK1）及对照组（ShCtr1）的细胞凋亡率。4.2用慢病毒下调Kasumi-1细胞中PAK1的表达后,分别用不同浓度的Ara-C（4 μM、8 μM）或 IDA（20 μg/L、40 μg/L）处理 24 h,利用 Annexin V-FITC/7-ADD双染与流式细胞术检测PAK1下调组（ShPAK1）及对照组（ShCtr1）的细胞凋亡率。5.小分子抑制剂抑制PAK1表达使用选择性非ATP竞争性PAK1小分子抑制剂IPA-3抑制PAK1表达。首先分别用不同浓度IPA-3（0 μM、10 μM和20μM）处理THP1和Kasumi-1细胞12小时和24小时。Western blot方法检测AML细胞中p-PAK1和PAK1的表达,验证IPA-3对AML细胞PAK1表达的影响。6.小分子抑制剂对AML细胞增殖及凋亡的影响6.1用不同浓度IPA-3（0μM、1μM、20μM）作用THP1细胞24小时,通过CCK-8检测THP1细胞的增殖能力。6.2分别用20 和30 IPA-3处理THP1和Kasumi-1细胞24小时,通过Annexin V/PI试剂盒及流式细胞术检测细胞凋亡率。7.小分子抑制剂对AML细胞药物敏感性的影响7.1 用 IPA-3（10 μM）和 Ara-C（1 μM）或 IDA（10μg/L）处理 THP1 细胞 24小时,应用CCK-8检测方法测定细胞的增殖能力。7.2用IPA-3（10μM）和Ara-C（1 μM）或IDA（10 μg/L）处理THP1细胞24小时,利用凋亡试剂盒及流式检测术检测IPA-3联合化疗药物诱导的THP1细胞的凋亡率。8.PAK1调控ERK信号通路的研究8.1首先利用GEPIA和TCGA数据库,分析AML患者中PAK1与ERK1、ERK2在mRNA表达水平上的相关性。8.2然后用慢病毒或IPA-3抑制THP1和Kasumi-1细胞中PAK1的表达,Western Blot检测ERK1/2和磷酸化p-ERK在蛋白水平上的表达变化。9.统计分析利用SPSS V20.0软件进行数据分析。实验数据均以平均值±标准差表示。数据来自至少三个独立实验。使用配对或不配对t检验评估两组之间的统计差异。三组及以上组间差异通过方差分析或非参数检验分析。P＜0.05被认为差异具有统计学意义。研究结果1.建立PAK1稳定下调的AML细胞株我们应用含有PAK1 shRAN的慢病毒感染THP1和Kasumi-1细胞,流式分选GFP阳性细胞后进行扩增,荧光显微镜和流式荧光分析显示PAK1下调组（ShPAK1）及对照组（ShCtr1）细胞转染效率均超过95%。2.验证慢病毒转染后AML细胞中PAK1的表达下降Real-time RT-PCR 和 Western blot 结果显示,转染慢病毒后 THP1 和 Kasumi-1细胞中PAK1表达在mRNA和蛋白水平上均明显低于阴性对照组。表明携带PAK1 shRNA的慢病毒可显著下调THP1和Kasumi-1细胞中PAK1的表达。3.PAK1表达下调对THP1及Kasumi-1细胞增殖的影响CCK-8实验结果显示,与阴性对照组（ShCtr1）相比,PAK1下调组（ShPAK1）中THP1细胞在d2-d4细胞增殖能力下降,Kasumi-1细胞在d4观察到类似的增殖抑制现象,提示下调PAK1的表达能够降低AML细胞的增殖能力。4.PAK1表达下调对THP1及Kasumi-1细胞凋亡的影响凋亡检测结果显示,PAK1下调组中THP1和Kasumi-1细胞的凋亡率均高于阴性对照组,两组之间存在统计学差异,提示下调PAK1的表达能促进AML细胞的凋亡。5.PAK1表达下调对THP1及Kasumi-1细胞化疗药物敏感性的影响选用不同浓度的化疗药物Ara-C和IDA分别处理PAK1下调组及对照组的AML细胞。结果表明,下调PAK1能显著增加Ara-C和IDA诱导的AML细胞凋亡。说明下调PAK1可以提高AML细胞对化疗药物的敏感性。6.小分子抑制剂IPA-3对AML细胞PAK1表达的影响Western blot检测结果显示PAK1小分子抑制剂IPA-3能显著降低p-PAK1和PAK1的表达,且随着IPA-3浓度的增加,PAK1表达的抑制作用更加显著。7.小分子抑制剂IPA-3对AML细胞增殖及凋亡的影响7.1小分子抑制剂IPA-3可显著抑制THP1细胞的增殖能力,而且随着IPA-3浓度的增加,THP1细胞活力降低更加明显。7.2 凋亡检测表明,与对照组相比,IPA-3处理组TPH1及Kasumi-1细胞凋亡率增加,提示IPA-3抑制PAK-1可以促进AML细胞凋亡。8.小分子抑制剂IPA-3对AML细胞药物敏感性的影响8.1 CCK-8检测显示:IPA-3联合Ara-C或IDA处理THP1细胞后,与单用Ara-C或IDA处理组相比,THP1细胞抑制率显著增加。8.2凋亡检测结果显示,IPA-3联合Ara-C或IDA处理THP1及Kasumi-1细胞后,与单用Ara-C或IDA处理组相比,细胞凋亡率显著增加。9.PAK1调控ERK信号通路的研究9.1数据库分析结果显示:在AML患者中ERK1和ERK2在mRNA水平的表达与PAK1表达呈正相关关系。9.2在THP1和Kasumi-1细胞中,用慢病毒或IPA-3抑制PAK1表达,Western Blot检测结果显示随着PAK1表达的降低,磷酸化ERK1/2的表达也显著降低,说明PAK1可以调控ERK信号通路。研究结论1.下调PAK1的表达可明显抑制AML细胞增殖、促进细胞凋亡。2.下调PAK1的表达可增强AML细胞对Ara-c/IDA传统化疗药物的敏感性。3.PAK1可能通过调控ERK1/2信号通路在AML中发挥作用。第三部分PAK1在骨髓基质细胞介导AML耐药中的作用及机制研究研究目的阐明PAK1在BMSC介导的AML细胞耐药中的作用,以及BMSC介导AML化疗耐药的下游信号通路。研究方法1.共培养模型1.1直接接触共培养模型1)将人骨髓基质细胞HS-5铺到细胞培养板中过夜贴壁,吸去培养液后加入新鲜的完全培养基。2)取对数生长期的原代AML细胞、THP1细胞、Kasumi-1细胞及KG1细胞,调整细胞密度后加入上述已经贴壁的HS-5细胞之上培养（AML细胞:基质细胞比例为1:1）24小时。1.2 Transwell间接共培养模型1)将HS-5细胞铺到细胞培养板中过夜贴壁,吸去培养液后加入新鲜的完全培养基,将Transwell小室放置于孔板之上。2)取对数生长期的AML细胞加入Transwell小室之中培养（AML细胞:基质细胞比例为1:1）24小时。2.细胞免疫荧光检测将THP1细胞与HS-5细胞在直接共培养或间接共培养模型中培养24小时,收集THP1细胞行细胞免疫荧光检测,使用荧光显微镜观察PAK和p-PAK1的荧光表达情况并拍照。3.Western blot 检测将原代AML细胞和AML细胞系（THP1、Kasumi-1和KG1）与HS-5细胞单独或共培养模型中培养24小时,收集AML细胞并提取总蛋白,应用蛋白质印迹检测AML细胞中PAK1和p-PAK1的蛋白表达水平。4.细胞凋亡检测4.1将原代AML细胞、THP1细胞或Kasumi-1细胞单独或与HS-5细胞共培养过夜,然后用2μM Ara-C处理AML细胞24小时。应用AnnexinV-FITC/7-AAD凋亡试剂盒及流式细胞术检测细胞凋亡率。4.2应用shRNA慢病毒下调THP1细胞及Kasumi-1细胞中PAK1表达后,将AML细胞与HS-5细胞直接或间接共培养,然后用2μM Ara-C处理AML细胞24小时,流式细胞术检测细胞凋亡率。4.3将THP1细胞与HS-5细胞直接或间接共培养后,加入IPA-3（20μM）和Ara-C（2 μM）处理24小时,流式细胞术检测细胞凋亡率。5.下游机制检测首先应用慢病毒转染THP1细胞及Kasumi-1细胞,下调PAK1表达,然后将AML细胞单独或与HS-5细胞直接接触或间接接触共培养24小时,再应用Ara-C 20 μM 处理细胞 24 小时,Westerm blot 检测 PAK1、p-PAK1、ERK1/2、p-ERK1/2及凋亡基因PARP、cleaved-PARP的表达情况,GAPDH用作内参。6.统计方法使用SPSS V20.0进行统计分析。实验数据均以平均值±标准差表示。数据来自至少三个独立实验。使用配对或不配对t检验评估两组之间的统计差异,使用单因素方差分析来明确多组之间的差异。当P＜0.05时,差异可被认为具有统计学意义。研究结果1.Western blot检测BMSC共培养后AML细胞中PAK1的表达水平与AML细胞单独培养相比,HS-5细胞共培养模型中的AML细胞PAK1以及磷酸化的PAK1（p-PAK1）蛋白表达明显增高,且直接共培养模型中PAK1和p-PAK1表达水平升高更明显。2.免疫荧光检测BMSC共培养后AML细胞中PAK1的表达水平细胞免疫荧光检测显示,当AML细胞与骨髓基质细胞共培养时,PAK和p-PAK1的荧光表达增强。此外,PAK1和p-PAK1的荧光表达在直接共培养模型中比在间接Transwell共培养模型中更高。3.BMSC共培养后化疗药物诱导的AML细胞凋亡减少与AML细胞单独培养相比,Ara-C诱导的AML细胞凋亡率在两种共培养模型中均显著减少,并且直接共培养模型中AML细胞的凋亡率低于间接Transwell共培养模型,这与PAK1表达正好相反。提示PAK1可能在骨髓基质细胞介导的AML细胞耐药中发挥重要作用。4.应用慢病毒下调PAK1表达能逆转BMSC介导的AML细胞耐药应用shRNA慢病毒下调THP1细胞及Kasumi-1细胞中PAK1表达后,将AML细胞与HS-5细胞直接或间接共培养,然后用Ara-C处理AML细胞24小时。流式细胞术检测显示,PAK1下调后共培养模型中AML细胞的凋亡率较对照组明显增加。5.IPA-3抑制PAK1表达能减弱BMSC对AML细胞的保护作用将AML细胞与HS-5细胞直接或间接共培养后,应用Ara-C单独或联合IPA-3处理24小时,流式细胞术检测显示IPA-3联合Ara-C处理组AML细胞的凋亡率较Ara-C单独处理组明显增加。表明抑制PAK1可以减弱BMSCs对AML细胞的保护作用,增加AML细胞对化疗药物的敏感性。6.下调PAK1能抑制BMSC介导的ERK信号通路的激活Western blot检测结果显示,AML细胞与HS-5细胞共培养后,磷酸化ERK1/2的表达水平与单独培养相比显著增加,这一现象与PAK1和p-PAK1的表达情况一致。下调AML细胞中PAK1表达后,共培养组AML细胞p-ERK1/2表达也随之降低。同时,无论是单独培养还是在共培养模型中,抑制PAK1表达后,细胞凋亡分子cleaved-PARP的表达都会显著增加。提示下调PAK1能抑制BMSC介导的ERK信号通路的激活。研究结论1.PAK1在BMSC介导的AML细胞耐药中发挥一定作用。2.抑制PAK1可减弱BMSC对AML细胞的保护作用,提高AML细胞对化疗药物的敏感性。3.BMSC介导的AML化疗耐药可能与PAK1激活ERK1/2-cleavd-PARP信号通路有关。