研究背景腹腔镜作为一种颠覆性的技术,在过去的几十年里引发了外科手术的一场革命。腹腔镜手术视野清晰、方便录像,有利于带教和学术交流,极大的促进的微创手术的发展。宫颈癌是妇科最常见的恶性肿瘤之一。根治性子宫切除术（Radical Hysterectomy,RH）加盆腔淋巴结切除术是早期宫颈癌患者的标准治疗方式。大量研究结果表明,宫颈癌腹腔镜手术不仅出血少、住院时间短、术后并发症发生率低,而且大量研究结果显示宫颈癌腹腔镜手术与开腹手术相比患者的肿瘤学结局相似。宫颈癌腹腔镜手术因而被广泛推广,并被美国国立综合癌症网络（National Comprehensive Cancer Network,NCCN）和国际妇产科联盟（International Federation of Obstetrics and Gynecology,FIGO）指南推荐,成为开腹宫颈癌手术的可替代方案。然而,宫颈癌腹腔镜手术的安全性却仍存在争议。2018年,发表在《新英格兰杂志》的两篇文章的研究结果显示宫颈癌腹腔镜手术比传统的开腹手术有更高的病死率、复发率。因此,2021年NCCN指南指出开腹是宫颈癌根治性子宫切除术的标准术式（Ⅰ类证据）。这样的结果颠覆了人们以往对宫颈癌腹腔镜手术的认知,在妇科肿瘤学界引起巨大反响,引发国内外学术界的热议。中国的宫颈癌患者数量庞大,每年的新发病例占全球的19%,探究宫颈癌腹腔镜手术复发率高的原因和寻找解决方案成为亟待解决的问题。于是,国内外专家在2019年10月举办的“国际子宫颈癌腹腔镜手术治疗临床研究大会”上进行了深入的讨论,认为宫颈癌腹腔镜手术肿瘤学结局差的可能原因有:手术中无瘤原则的执行、举宫器的使用、超声刀气化、二氧化碳（Carbon Dioxide,CO2）气腹、离断阴道的方法以及手术医生的经验和技术水平等。本研究将从超声刀的使用和CO2气腹两个方面着手,试图从临床和基础研究等多方面探讨宫颈癌腹腔镜手术患者肿瘤学结局差的原因,为宫颈癌治疗方式的选择提供决策依据。第一章:腹腔镜超声刀对早期宫颈癌患者预后的影响研究背景及目的腹腔镜手术对于器械的依赖性很强,各种能量器械的应用推动了妇科微创手术的发展。超声刀兼具切割和凝闭功能、侧方热损伤小,逐渐成为大多数宫颈癌腹腔镜手术的首选。超声刀通过高频振动进行组织切割,在刀头震荡的作用下组织碎末会以气雾的形式向四周飞散。而超声刀切割时的温度只有40℃～100℃。国内外研究显示,超声刀激发时产生的气雾可以携带有活性的肿瘤细胞。那么,腹腔镜根治性子宫切除术（Laparoscopic Radical Hysterectomy,LRH）中使用超声刀与宫颈癌腹腔镜手术肿瘤学结局差是否有关联?本研究通过比较腹腔镜手术中使用超声刀与使用EnSeal及传统开腹手术进行RH的临床疗效,探讨腹腔镜使用超声刀对早期宫颈癌患者预后的影响。研究方法回顾性分析2013年1月至2018年12月期间于山东省千佛山医院实施RH的宫颈癌患者的临床资料。根据手术入路和手术器械选择不同,将患者分为腹腔镜EnSeal组（LRH-E）、腹腔镜超声刀组（LRH-U）和开腹组（ARH）。比较3组患者的无进展生存期（Progression Free Survival,PFS）、总生存期（Overall Survival,OS）、手术时间、估计出血量、输血率、术后排气时间、腹膜后淋巴结切除数目、术后淋巴囊肿的发生率。研究结果总共纳入117例患者,其中LRH-E组35例,LRH-U组46例,ARH组36例。3组患者的年龄、体重、FIGO分期、病理类型、肿瘤分级和大小、辅助治疗率均无统计学差异（P＞0.05）。LRH-E组随访9～71个月,LRH-U组随访5～87个月,ARH组随访15～95个月。Kaplan-Meier生存分析显示3组患者PFS和OS无统计学差异（P＞0.05）。LRH-E组的手术时间和估计出血量均小于LRH-U和ARH组。LRH-E组和LRH-U组相比,术后排气时间和切除淋巴结数目无统计学差异（P＞0.05）。LRH-E组和LRH-U组患者的术后排气时间小于ARH组（P＜0.05）,切除淋巴结数目大于ARH组（P＜0.05）。此外,3组患者的淋巴囊肿发生率没有统计学差异（P＞0.05）。研究结论有限的回顾性病例对照研究没有发现在早期宫颈癌患者中使用超声刀进行LRH会增加肿瘤转移复发的风险。第二章:CO2气腹对宫颈癌细胞增殖、凋亡和裸鼠移植瘤的影响研究背景及目的腹腔镜除了特别依赖能量器械之外,与传统开腹手术截然不同的是需要建立人工气腹。CO2是腹腔镜气腹介质的首选,它不仅价格便宜、容易获得、不易燃,而且它在血液中的溶解度高,可以快速吸收和排出体外。研究显示CO2气腹与恶性肿瘤盆腹腔转移和穿刺口种植密切相关,但CO2气腹对肿瘤细胞增殖的影响存在争议,而且关于CO2气腹对宫颈癌细胞影响的研究报道较少。本部分主要研究CO2气腹对宫颈癌细胞增殖、凋亡和裸鼠成瘤的影响,探讨CO2气腹对宫颈癌腹腔镜手术患者预后的影响。研究方法使用聚丙烯密封箱及奥林巴斯气腹机建立体外CO2气腹模型。选用宫颈癌细胞系HeLa和SiHa细胞,分为CO2组和对照组。CO2组细胞使用CO2气腹模型在13mmHg压力下刺激4个小时,对照组细胞在常规条件下培养。采用CCK-8法、平板克隆形成实验和裸鼠皮下成瘤实验检测宫颈癌细胞系HeLa和SiHa的增殖及成瘤能力。使用FITC-AnnexinV和PI进行细胞染色,采用流式细胞术检测细胞凋亡率及细胞周期分布。构建小鼠体内CO2气腹模型,腹腔注射HeLa细胞后,进行CO2气腹处理（6mmHg,60分钟）。4周后处死并解剖小鼠,将腹腔转移瘤剥离并称重,观察计算实验性腹膜癌转移指数（Experimental Peritoneal Carcinomatosis Index,ePCI）评分和肿瘤负荷。研究结果CCK-8实验结果显示:与对照组相比,CO2组HeLa和SiHa细胞虽然在初期细胞活力下降,但后期细胞增殖活性显著增加。HeLa细胞从第4天开始,细胞增殖活性显著大于对照组（P＜0.05）,SiHa细胞第5天开始细胞增殖活性显著大于对照组（P＜0.05）。平板克隆形成实验结果表明,CO2气腹刺激后,HeLa和SiHa细胞平板克隆形成率分别由19.9%、22.5%增加至28.7%、29.7%（P＜0.05）。CO2气腹刺激后放回常规培养箱继续培养24小时,收集细胞进行流式细胞术分析。结果显示,HeLa（SiHa）细胞CO2组与对照组的细胞凋亡率分别为12.4%（10.6%）和 6.2%（8.0%）。CO2 组 HeLa 细胞的 G2 期细胞数由 14.0%±0.7%增加到19.2%±0.4%（P＜0.05）。而SiHa细胞G2期细胞数由15.6%±0.7%增加到19.4%±0.5%（P＜0.01）。小鼠体内CO2气腹模型（6mmHg,60分钟）进行刺激后,CO2组小鼠的肿瘤负荷显著大于对照组（P＜0.01）,CO2组小鼠的ePCI评分显著高于对照组（P＜0.05）。研究结论1.体外CO2气腹促进宫颈癌细胞系HeLa和SiHa的细胞增殖,并能促进皮下移植瘤生长。2.体内CO2气腹可以促进宫颈癌HeLa细胞在裸鼠腹腔内的生长,并能促进肿瘤播散。第三章:CO2气腹对宫颈癌细胞增殖的蛋白质组学及分子机制的初步研究研究背景及目的CO2气腹不仅会对患者的呼吸、循环、泌尿等系统产生不良影响,还会对肿瘤细胞的生长和转移产生广泛影响。本课题第二部分研究结果显示,CO2气腹可以促进宫颈癌细胞增殖以及促进小鼠皮下及腹腔成瘤,其分子机制目前尚不清楚。CO2气腹可以同时引起细胞乏氧及细胞环境的酸化,对宫颈癌细胞生物学功能的影响是多因素的。而蛋白质组学可以高通量、高效率地对样品进行分析,够揭示与疾病直接相关的相关蛋白质,广泛运用在疾病机理的研究中。本部分通过TMT标记的蛋白质组学技术从蛋白质水平上研究CO2气腹对宫颈癌细胞的影响机制,并探究CO2气腹促进宫颈癌细胞增殖的可能调控通路。研究方法使用体外模拟CO2气腹模型（13mmHg,4小时）刺激HeLa细胞后收集细胞,提取细胞蛋白质,用FASP方法将蛋白酶解成肽段。使用TMT蛋白标记试剂盒进行同位素标记,用高pH值反相肽分离试剂盒进行分级,然后用Q-Exactive质谱仪进行质谱分析。采用软件Mascot 2.2和Proteome Discoverer 1.4进行查库鉴定及定量分析。以表达倍数＞1.2倍（上调大于1.2倍或下调小于0.83倍）且P＜0.05（T-test或其他）为标准,得到差异表达的蛋白质。使用Complexheatmap R包进行聚类分析,采用CELLO的方法进行亚细胞定位预测,使用InterProScan软件包和Pfam数据库进行蛋白结构域分析,利用Blast2GO对目标蛋白质集合进行GO注释,利用KAAS软件对目标蛋白质集合进行KEGG通路注释。采用Fisher精确检验对目标蛋白集合进行GO注释或KEGG注释的富集分析。使用酸度计测量体外模拟CO2气腹刺激前、后细胞外液pH值的变化。实验中通过模拟CO2气腹引起的乏氧及酸性环境条件,采用CCK-8法研究两种因素对宫颈癌细胞增殖的不同作用。采用Western blot检测CO2刺激以及加入PI3K通路抑制剂后细胞增殖和PI3K/Akt通路相关蛋白表达的变化。构建裸鼠体内CO2气腹模型,研究PI3K抑制剂LY294002对肿瘤腹腔成瘤的影响。研究结果体外CO2气腹环境引起宫颈癌HeLa细胞蛋白表达的改变,对宫颈癌细胞的生物学功能产生了一定的影响。本项目共获得160273个谱图、64387个鉴定的肽段、6778个鉴定的蛋白。CO2气腹刺激后鉴定出177个显著性差异表达蛋白,其中115个上调蛋白,62个下调蛋白。亚细胞定位分析结果显示,与线粒体功能相关的差异表达蛋白有26个,占总数的11.9%。蛋白结构域分析结果显示,差异表达蛋白在CHCH结构域蛋白家族、带3蛋白、MRG受体家族、HCO3转运因子家族、质子传导膜转运体等方面显著富集。GO功能注释及富集分析结果提示,整合素介导的细胞粘附、骨髓白细胞激活和细胞外基质的构筑等重要生物学过程的蛋白质发生了显著变化。KEGG通路分析及富集分析显示,p53信号通路、β丙氨酸代谢、细胞外基质受体相互作用、PI3K/Akt信号通路及氧化磷酸化等重要通路蛋白显著富集。CO2气腹处理开始后,细胞外液pH值迅速下降。气腹压力越大,pH下降速度越快。气腹停止作用后,细胞外液pH值逐渐升高,5个小时后恢复至对照组的pH值水平。CCK-8实验结果显示,细胞外液酸化抑制细胞增殖,乏氧环境促进细胞增殖。使用PI3K抑制剂之后,p-Akt的表达水平及细胞增殖活性均显著降低（P＜0.05）。与对照组相比,CO2组裸鼠的ePCI评分显著高于对照组（P＜0.05）。与CO2组相比,CO2+LY294002组裸鼠的ePCI评分没有显著变化。裸鼠处死后,将腹腔所有瘤体剥离后称重,发现CO2组裸鼠肿瘤负荷显著大于对照组（P＜0.05）,而给予CO2+LY294002组的肿瘤负荷显著小于CO2组（P＜0.05）。研究结论1.体外模拟CO2气腹通过细胞乏氧及细胞酸化影响宫颈癌细胞系HeLa细胞的生物学行为。2.CO2气腹可能通过激活PI3K/Akt信号通路促进宫颈癌HeLa的细胞增殖。