论文部分内容阅读
1.目的应用体外细胞实验和临床关联规则分析的技术与方法,探讨lncRNA MAPKAPK5-AS1（简称lncRNA MK5-AS1或MK5-AS1）/miR-146a-3p/SIRT1组合介导类风湿关节炎（rheumatoid arthritis,RA）免疫炎症和凋亡逃逸的机制及新风胶囊（xinfeng capsule,XFC）的干预作用。2.方法2.1实验一:LncRNA MK5-AS1/miR-146a-3p/SIRT1组合介导RA成纤维样滑膜细胞免疫炎症和凋亡逃逸的机制本实验以RA患者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）与RA滑膜成纤维细胞（fibroblast-like synoviocytes,FLS）共培养为细胞模型;构建基因过表达质粒和小干扰RNA,并转染至RA-FLS中;荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization,FISH）检测lncRNA MK5-AS1的定位;RNA pull down、RNA免疫共沉淀（RNA immunoprecipitation,RIP）、双荧光素酶报告实验及系列回复性实验,验证lncRNA MK5-AS1、miR-146a-3p、SIRT1之间的靶向调控关系及对炎症、凋亡的影响。实时定量PCR法（real time quantitative PCR,RT-q PCR）检测lncRNA MK5-AS1、miR-146a-3p和SIRT1的表达;细胞计数试剂盒8（cell counting kit-8,CCK-8）法检测细胞活力;酶联免疫吸附法（enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA）检测炎症因子白细胞介素-6（interleukin-6,IL-6）、白细胞介素-8（interleukin-8,IL-8）、白细胞介素-4（interleukin-4,IL-4）和白细胞介素-10（interleukin-10,IL-10）的表达;免疫蛋白印迹法（western blot,WB）检测凋亡蛋白Bcl2相关X的蛋白质（bcl2-associated X,Bax）、B淋巴细胞瘤-2基因（B-cell lymphoma-2,Bcl-2）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（cysteine-containing aspartate-specific proteases 3,caspase3）、caspase8及核因子-κB（nuclear factor-k-gene binding,NF-κB）通路指标的表达;流式细胞术（flow cytometry,FCM）检测细胞凋亡率。MK5-AS1/miR-146a-3p/SIRT1组合对RA成纤维样滑膜细胞免疫炎症和凋亡逃逸的影响2.2实验二:新风胶囊含药血清通过调控lncRNA制备XFC含药血清,观察XFC含药血清对细胞活力、lncRNA MK5-AS1、miR-146a-3p、SIRT1、炎症、凋亡指标的影响;通过系列回复实验,在XFC含药血清干预的基础上,转染si-MK5-AS1、miR-146a-3p inhibitor及SIRT1过表达质粒,观察炎症、凋亡指标的变化。2.3实验三:基于关联规则分析研究RA患者lncRNA MK5-AS1/miR-146a-3p/SIRT1组合、免疫炎症及凋亡逃逸指标的变化及新风胶囊对其的影响采用自身对照试验的方法,收集健康人及XFC治疗前后RA患者的PBMCs,检测lncRNA MK5-AS1、miR-146a-3p、SIRT1、炎症、凋亡指标的表达,同时收集RA患者实验室指标及患者感受,观察lncRNA MK5-AS1/miR-146a-3p/SIRT1组合与RA患者临床指标、患者感受、炎症及指标间的相关性;应用关联规则分析研究XFC治疗与lncRNA MK5-AS1、miR-146a-3p、SIRT1、临床指标、患者感受、炎症及凋亡指标改善之间的关联性。3.结果3.1实验一:Lnc RNA MK5-AS1/miR-146a-3p/SIRT1组合介导RA成纤维样滑膜细胞免疫炎症和凋亡逃逸的机制（1）RA-PBMCs刺激RA-FLS共培养模型的最佳比例:CCK-8结果表明,筛选出RA-PBMCs刺激RA-FLS的最佳数量比例为2.5∶1、最佳时间为48h。（2）Lnc RNA MK5-AS1、miR-146a-3p、SIRT1在RA-FLS中的表达:RT-q PCR结果表明,lncRNA MAK5-AS1、SIRT1在RA-FLS中表达降低,miR-146a-3p在RA-FLS中表达升高。（3）Lnc RNA MK5-AS1、miR-146a-3p、SIRT1在RA-FLS中的转染效率:RT-q PCR结果表明,si-MK5-AS1、si-SIRT1转染后lncRNA MK5-AS1和SIRT1的表达降低;OV-MK5-AS1、OV-SIRT1转染后lncRNA MK5-AS1和SIRT1的表达升高;RA-FLS中转染miR-146a-3p mimic后miR-146a-3p的表达升高;RA-FLS中转染miR-146a-3p inhibitor转染后miR-146a-3p的表达降低。（4）Lnc RNA MK5-AS1在RA-FLS中的定位:FISH实验结果表明,lncRNA MK5-AS1分布于RA-FLS的细胞质中。（5）Lnc RNA MK5-AS1干扰/过表达状态对RA-FLS炎症和凋亡指标的影响:Lnc RNA MK5-AS1的功能表型实验表明,OV-MK5-AS1后,促炎因子IL-6和IL-8、抑凋亡蛋白Bcl-2降低,抑炎因子IL-4和IL-10、促凋亡蛋白Bax、caspase3和caspase8升高,细胞凋亡率增加;si-MK5-AS1后,促炎因子IL-6和IL-8、抑凋亡蛋白Bcl-2升高,抑炎因子IL-4和IL-10、促凋亡蛋白Bax、caspase3和caspase8降低,细胞凋亡率减少。（6）Lnc RNA MK5-AS1、miR-146a-3p、SIRT1调控关系的验证:双荧光素酶报告实验结果表明,在MK5-AS1-WT和SIRT1-WT组中,与mimic NC组相比,miR-146a-3p mimic组荧光素酶活性降低,在MK5-AS1-MUT和SIRT1-MUT组中,与mimic NC组相比,miR-146a-3p mimic组荧光素酶活性无显著变化;RIP实验结果表明,以Ig G作为阴性对照,与si-NC组相比,si-MK5-AS1组miR-146a-3p和SIRT1的表达降低,si-MK5-AS1后,AGO2结合了更多的miR-146a-3p和SIRT1,说明MK5-AS1可以竞争性吸附miR-146a-3p;RNA pull down实验结果表明,与MK5-AS1 negative组相比,MK5-AS1 positive组miR-146a-3p表达升高,说明MK5-AS1 positive组探针能够显著富集miR-146a-3p,MK5-AS1能够与miR-146a-3p结合。lncRNA MAK5-AS1与miR-146a-3p、miR-146a-3p与SIRT1具有结合位点,能形成ce RNA组合。（7）回复实验1:miR-146a-3p mimic回复过表达lncRNA MK5-AS1对RA-FLS炎症和凋亡指标的影响:结果表明,在OV-MK5-AS1的基础上,共转染了miR-146a-3p mimic,促炎因子IL-6和IL-8、抑凋亡蛋白Bcl-2升高,抑炎因子IL-4和IL-10、促凋亡蛋白Bax、caspase3和caspase8降低,细胞凋亡率减少。（8）回复实验2:si-SIRT1回复过表达lncRNA MK5-AS1对RA-FLS炎症、凋亡指标和NF-κB通路的影响:结果表明,在OV-MK5-AS1的基础上,共转染了si-SIRT1,促炎因子IL-6和IL-8、抑凋亡蛋白Bcl-2升高,NF-κB通路激活,抑炎因子IL-4和IL-10、促凋亡蛋白Bax、caspase3和caspase8降低,细胞凋亡率减少。MK5-AS1/miR-146a-3p/SIRT1组合对RA成纤维样滑膜细胞免疫炎症和凋亡逃逸的影响3.2实验二:新风胶囊含药血清通过调控lncRNA（1）XFC含药血清对RA-FLS细胞活力的影响:CCK-8实验结果表明,10%XFC在48h对RA-FLS的抑制最佳,故选此为最佳干预浓度与时间。（2）XFC含药血清对RA-FLS中lncRNA MK5-AS1/miR-146a-3p/SIRT1组合、炎症和凋亡指标的影响:XFC含药血清能升高lncRNA MK5-AS1、SIRT1、IL-4、IL-10、Bax、caspase3、caspase8的表达,降低miR-146a-3p、IL6、IL-8、Bcl-2、IKKa、p-p65的表达。（3）回复实验1:XFC含药血清通过lncRNA MK5-AS1对RA-FLS炎症和凋亡指标的影响:结果表明,在XFC含药血清干预的基础上,转染了si-MK5-AS1,促炎因子IL-6和IL-8、抑凋亡蛋白Bcl-2升高,抑炎因子IL-4和IL-10、促凋亡蛋白Bax、caspase3和caspase8降低。（4）回复实验2:XFC含药血清通过lncRNA MK5-AS1/miR-146a-3p对RA-FLS炎症和凋亡指标的影响:结果表明,在XFC含药血清干预和si-MK5-AS1的基础上,转染了miR-146a-3p inhibitor,促炎因子IL-6和IL-8、抑凋亡蛋白Bcl-2降低,抑炎因子IL-4和IL-10、促凋亡蛋白Bax、caspase3和caspase8升高。（5）回复实验3:XFC含药血清通过lncRNA MK5-AS1/SIRT1对RA-FLS炎症、凋亡指标和NF-κB通路的影响:在XFC含药血清干预和si-MK5-AS1的基础上,转染了SIRT1过表达质粒,促炎因子IL-6和IL-8、抑凋亡蛋白Bcl-2降低,抑炎因子IL-4和IL-10、促凋亡蛋白Bax、caspase3和caspase8升高。3.3实验三:基于关联规则分析研究RA患者lncRNA MK5-AS1/miR-146a-3p/SIRT1组合、免疫炎症及凋亡逃逸指标的变化及新风胶囊对其的影响（1）Lnc RNA MK5-AS1、miR-146a-3p、SIRT1在RA患者中的表达:与健康对照（healthy controls,HCs）组相比,lncRNA MK5-AS1、SIRT1在RA患者中表达降低（P＜0.001）,miR-146a-3p表达升高（P＜0.001）;受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve,ROC）结果表明,lncRNA MK5-AS1、miR-146a-3p、SIRT1的AUC均大于70%,说明三者可作为协助诊断RA的分子生物学标志物。（2）Lnc RNA MK5-AS1/miR-146a-3p/SIRT1组合与RA患者临床指标、患者感受、炎症和凋亡指标的相关性分析:相关性分析结果表明,RA患者lncRNA MK5-AS1、miR-146a-3p、SIRT1与临床指标（ESR、hs-CRP、RF、IGG等）、患者感受（DAS28评分、脾虚湿盛证证候积分、SF-36评分）、炎症因子及凋亡指标等具有显著的相关性（P＜0.05或P＜0.01或P＜0.001）。（3）Lnc RNA MK5-AS1/miR-146a-3p/SIRT1组合与RA患者临床指标、患者感受、炎症和凋亡指标的关联规则分析:关联规则结果,RA患者lncRNA MK5-AS1、miR-146a-3p、SIRT1与临床指标、患者感受、炎症因子及凋亡指标等之间的支持度均大于40%、置信度均大于60%、提升度均大于1（P＜0.01）。（4）RA患者治疗前后lncRNA MK5-AS1/miR-146a-3p/SIRT1组合、临床指标、患者感受、炎症和凋亡指标的变化:与治疗前相比,RA患者治疗后miR-146a-3p、IL-8、Bcl-2、ESR、hs-CRP、RA症状积分和脾虚湿盛证证候积分等降低（P＜0.05或P＜0.01）,lncRNA MK5-AS1、SIRT1、IL-10、Bax、VT、SF和MH评分等升高（P＜0.05或P＜0.01）。（5）XFC与RA患者lncRNA MK5-AS1/miR-146a-3p/SIRT1组合、临床指标、患者感受、炎症和凋亡指标改善之间的关联规则分析:关联规则结果显示,XFC治疗与lncRNA MK5-AS1/miR-146a-3p/SIRT1组合、临床指标、患者感受、炎症因子及凋亡指标等之间的支持度均大于55%、置信度均大于75%、提升度均大于1（P＜0.01）,说明XFC治疗与研究指标的改善之间具有较强的关联性。4.结论（1）Lnc RNA MAK5-AS1作为ce RNA竞争性吸附miR-146a-3p,下调SIRT1的表达;lncRNA MAK5-AS1/miR-146a-3p/SIRT1形成ce RNA组合,介导RA免疫炎症和凋亡逃逸。（2）XFC含药血清能上调lncRNA MK5-AS1、SIRT1的表达,下调miR-146a-3p的表达,调控lncRNA MK5-AS1/miR-146a-3p/SIRT1组合,从而改善RA免疫炎症和凋亡逃逸。（3）RA患者lncRNA MK5-AS1/miR-146a-3p/SIRT1组合与临床指标、患者感受、炎症及凋亡指标具有显著相关性;XFC在改善RA患者lncRNA MK5-AS1、miR-146a-3p、SIRT1的同时,也能抑制免疫炎症和凋亡逃逸,从而改善临床指标和患者感受。