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研究目的睡眠是一种生理过程,对维持机体的身心健康具有重要作用。倒时差和轮转工作所引起的睡眠不足可导致机体产生生理紊乱甚至病理损伤反应。代谢系统对睡眠状态极为敏感,睡眠缺失导致的代谢功能扰动可表现为三大营养物质代谢失衡、毒性代谢产物异常堆积、代谢相关功能分子表达异常。因此开展睡眠缺失致代谢功能扰动机制研究意义重大。本课题在后勤科研重大项目资助下,从生物钟与生物节律角度探究睡眠剥夺致骨骼肌功能紊乱的分子机理研究。我们通过揭示睡眠缺失诱导生物钟基因表达异常在介导骨骼肌功能紊乱中的贡献和作用,为持续作业人员的代谢功能维护提供基于节律生物学研究的新内容。研究内容首先研究睡眠缺失条件下血清褪黑素及骨骼肌组织中昼夜钟蛋白振荡表达变化;其次探究睡眠缺失对骨骼肌运动耐力、力量、骨骼肌质量、糖代谢稳态的影响;再次探究生物钟基因缺失（PER2）对骨骼肌运动耐力、力量、骨骼肌质量、糖代谢稳态的影响;最后我们探究生物钟运行扰动介导睡眠缺失致骨骼肌功能紊乱的分子机制。研究方法将雄性大鼠连续睡眠剥夺72小时,利用小动物跑步机及大小鼠握力测定仪分别检测小鼠的运动耐力和大鼠的抓力;运用分析天平及HE染色分别检测并分析大鼠的腓肠肌重量及横截面积;利用糖原检测试剂盒、葡萄糖检测试剂盒、乳酸检测试剂盒分别检测大鼠腓肠肌的糖原含量、葡萄糖含量、乳酸含量;采用蛋白免疫印迹法（Western-Blot）检测生物钟基因BMAL1、CLOCK、PER2、CRY1、CRY2、REV-ERBα、RORα、HLF,以及骨骼肌萎缩因子MURF1,糖代谢的关键信号分子HXII、PFKM、PKM、TIGAR、LDHA、PDH-E1、PDK4、PCB、GLUT4的表达变化;采用逆转录PCR检测骨骼肌萎缩因子MURF1和IL-6基因的m RNA表达水平。其次在野生型及生物钟基因PER2敲除小鼠中比较上述指标的变化情况。为了探究睡眠缺失致骨骼肌功能紊乱的生物钟调控机制研究,我们在C2C12肌管细胞中敲低生物钟蛋白PER2和其它关键信号分子的表达水平,采用Western-Blot和RT-PCR检测骨骼肌代谢功能重要调节因子的蛋白及m RNA表达水平变化;最后利用免疫共沉淀（IP）技术探究睡眠缺失条件下生物钟蛋白与涉及调节骨骼肌功能紊乱的信号通路蛋白关系。研究结果第一章探究了睡眠缺失对中枢生物钟的体液输出信号——褪黑素的震荡表达变化水平及骨骼肌昼夜钟蛋白振荡表达变化的影响。结果发现:在24小时内对照组大鼠血清褪黑素及骨骼肌昼夜钟蛋白呈规律性的振荡表达,而睡眠剥夺组大鼠血清褪黑素和骨骼肌昼夜钟蛋白的振荡表达出现明显扰动。随后又分析了睡眠剥夺72小时骨骼肌昼夜钟蛋白的累积变化情况。结果发现:睡眠剥夺致生物钟基因PER2表达水平下调,并且在睡眠剥夺后恢复14天PER2仍处于下调状态。这些结果说明睡眠缺失可致中枢生物钟运行紊乱,进而影响外周骨骼肌的生物钟表达变化。第二章探究了睡眠缺失及生物钟基因缺失对骨骼肌生理功能的影响。结果发现:睡眠缺失导致骨骼肌运动耐力下降、腓肠肌的重量及横截面积降低、糖原含量减弱;同样条件下葡萄糖含量增加、乳酸堆积等异常现象。而后又发现生物钟基因PER2缺失小鼠运动耐力、前爪握力、腓肠肌重量均下降、腓肠肌内乳酸堆积等异常现象。这说明睡眠缺失诱导骨骼肌质量丢失,进而导致骨骼肌生理功能下降。更为重要的是,生物钟基因PER2参与调节骨骼肌正常生理功能。第三章探究了睡眠缺失诱导骨骼肌运动相关生理功能衰退的分子机制。结果发现伴随骨骼肌运动能力下降而出现的萎缩因子MURF1表达升高现象。进而证实了MURF1的表达上调反应源于转录促进,因此分析了MURF1的转录促进表达机制。结果发现MURF1基因启动子区存在转录因子STAT3的潜在结合位点,并且睡眠剥夺骨骼肌中STAT3显著活化。同样条件下骨骼肌中IL-6表达增加,p38K/ATF2（AP-1组成亚基）信号通路活化。随后,我们在C2C12肌管细胞中抑制上述信号分子活化及表达水平,并揭示了睡眠剥夺诱导p38K/ATF2/IL-6/STAT3信号通路活化并进一步有助于MURF1的上调反应。而后发现在相同条件下生物钟基因PER2表达下调能够介导MURF1表达水平上调反应,PER2作为结合伴侣负性调节p38K进而保持骨骼肌的稳态。睡眠剥夺诱导PER2下调导致p38K以及下游的信号通路蛋白活化。第四章探究了睡眠缺失诱导骨骼肌糖代谢紊乱的分子机制。结果发现:生理条件下生物钟基因PER2与AMPK存在着组成性的相互结合作用,PER2抑制AMPK的活化保持骨骼肌糖代谢稳态。在睡眠缺失条件下生物钟基因PER2表达降低导致AMPK活化,进一步促进糖酵解限速酶PFKM的表达最终导致糖酵解增加,乳酸堆积等糖代谢紊乱现象。在第五章中我们探究了睡眠缺失致骨骼肌炎性因子IL-1β表达升高的分子机制。首先发现IL-1β启动子区有XBP1s的潜在结合位点,并且睡眠缺失可诱导内质网应激蛋白IRE1α和XBP1s表达上调。在C2C12肌管细胞中我们发现了IRE1α和XBP1s能够促进IL-1β的转录表达,并最终揭示了睡眠缺失诱导骨骼肌IRE1α/XBP1s/IL-1β炎性反应信号通路活化。研究结论本论文研究结果揭示了睡眠缺失致大鼠中枢生物钟体液输出信号褪黑素昼夜节律消失及外周骨骼肌组织昼夜钟蛋白表达异常,提示睡眠缺失导致中枢及外周组织昼夜节律紊乱;进一步研究揭示了生物钟基因PER2介导睡眠缺失致骨骼肌功能紊乱以及关键代谢功能蛋白异常表达的信号传导机制。睡眠缺失可诱导骨骼肌组织PER2表达水平下调并引发p38K/ATF2/IL-6/STAT3/MURF1途径活化,进而导致骨骼肌萎缩变化;同时PER2表达水平下调也可引发AMPK/PFKM途径活化,进而导致骨骼肌乳酸堆积。最后,该论文还揭示了睡眠缺失诱导骨骼肌组织IRE1α/XBP1s/IL-1β炎性应激信号通路活化。以上研究首次揭示了睡眠缺失诱发骨骼肌功能紊乱的生物钟调控机制,靶向PER2、MURF1、PFKM等关键调节分子预期在持续作业体能维护中具有潜在应用价值。