Ghrelin在先天性膈疝大鼠模型胎肺中的表达及地塞米松产前治疗对其表达的影响

来源 :广州医学院 广州医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:chaos32167
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目的: 1.探讨正常妊娠大鼠不同胎龄胎鼠肺中Ghrelin的表达特点。 2.探讨Ghrelin在先天性膈疝大鼠模型胎肺发育过程中的变化和可能的作用。 3.探讨地塞米松对先天性膈疝胎肺中ghrelin表达的调节作用。 方法: 1.动物模型的建立将雌雄SD大鼠合笼过夜,翌日阴道涂片镜下检及精子视为妊娠,当天定为妊娠第0天。Nitrofen实验组以及Dex治疗组大鼠于妊娠第9.5天在吸入乙醚浅麻醉下插胃管,注入溶于1ml橄榄油的Nitrofen100mg,对照组大鼠仅注入1ml橄榄油。Dex组大鼠于18.5天和19.5天分别腹腔注射地塞米松(0.4mg/kg/d)。对Nitrofen诱导组孕鼠于妊娠第17.5,19.5,21.5天和对照组于妊娠第15.5,17.5,19.5,21.5天,行剖宫产取出胎鼠,称重后外科显微镜下解剖胎鼠,观察膈肌缺损情况,大小以及疝内容物;取出左右胎肺。视胎鼠有无膈疝将Nitrofen组胎鼠分为CDH组和无CDH组。Dex组则在妊娠第21.5天取出胎肺。胎肺取出后放于1.5ml EP管暂存于冰上。用于分子生物学检测的胎肺标本存于-80℃冰箱备用;用于免疫组化检测的标本则于10%甲醛溶液中固定24h,二甲苯透明,梯度酒精脱水,石蜡包埋,做3μm厚连续切片后备用。 2.实时荧光定量RT-PCR(QRT-PCR)检测Ghrelin mRNA在胎肺中的表达Trizol法提取胎肺标本总RNA,核酸定量仪检测各标本总RNA浓度,并用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定总 RNA 的完整性。采用一步法实时荧光定量 RT-PCR(Taqman 探针法)技术检测各标本中 Ghrelin 和内参β-actin mRNA的浓度(由标准曲线计算得出),然后分别经过内参校正和对照样本校正得出各胎肺标本中Ghrelin的相对表达量。 3.免疫组化检测胎肺标本中Ghrelin的表达采用二步法对胎肺中Ghrelin的表达进行免疫组织化学检测,DAB显色,棕黄色示Ghrelin免疫活性阳性。 结果: 1.CDH大鼠模型的构建对照组的8只孕鼠得到胎鼠95只。Nitrofen实验组12只孕鼠得到胎鼠134只,其中膈疝组(CDH组)88只,占65.67%(36/52);2只地塞米松治疗组孕鼠共产胎鼠26只,有膈疝的有16只,占61.54%;均为发生在后外侧的巨大膈疝。疝入胸腔的腹腔脏器主要为肝脏和胃,小肠和脾脏也有疝入。 2.QRT-PCR法检测Ghrelin在胎肺中的表达 2.1 Ghrelin在正常大鼠不同发育时期胎肺中的表达以21.5天胎龄的胎肺作为对照样本,21.5天的Ghrelin的相对表达量为1.00±0.24;15.5天,17.5天,19.5天胎龄的胎肺Ghrelin表达量分别为11.64±3.50,3.10±0.95,1.42±0.76。其中15.5天胎龄的胎肺Ghrelin表达量与其它三个组的比较有统计学差异(P<0.01)。17.5天与19.5天,21.5天的Ghrelin表达量有统计学差异(P<0.01),19.5天与21.5天的则无统计学差异(P=0.159)。 2.2 Ghrelin在CDH组大鼠不同发育时期胎肺中的表达以21.5天胎龄大鼠作为参照样本,17.5天,19.5天,21.5天胎龄的胎肺Ghrelin的相对表达量分别为5.96±1.25,2.80±0.48,1.00±0.37。Ghrelin在三个不同时期(17.5,19.5,21.5天)胎肺中的表达均有统计学差异(P<0.01)。 2.3 Ghrelin在17.5天胎龄胎鼠肺中的表达情况以对照组作为参照样本,对照组,CDH组和无CDH组胎肺Ghrelin的相对表达量分别为1.00±0.24,6.74±1.41,7.29±1.36。CDH 组和无CDH组的Ghrelin表达量比对照组高,差异具有统计学显著性(P<0.01)。CDH组和无CDH组间差异则无统计学显著性。 2.4 Ghrelin在19.5天胎龄胎鼠肺中的表达情况以对照组作为参照样本,对照组,CDH组和无CDH组胎肺Ghrelin的相对表达量分别为1.00±0.38,7.64±1.3,7.45±1.20。CDH组和无CDH组的Ghrelin表达量比对照组高,差异具有统计学显著性(P<0.01),CDH组和无CDH组间差异则无统计学显著性。 2.5 Ghrelin在21.5天胎龄胎龄胎鼠肺中的表达情况以对照组作为参照样本,对照组,CDH组,无CDH组和Dex组胎肺Ghrelin的相对表达量分别为1.00±0.24,4.31±1.58,3.62±0.67,1.27±0.26。CDH组和无CDH组的Ghrelin表达量均比对照组高,差异具有统计学显著性(P<0.01);CDH组和无CDH组间差异无统计学显著性;Dex组胎肺Ghrelin表达量较CDH组有明显降低(P<0.01)。 3.免疫组织化学检测对各组的4个标本进行免疫组化检测,结果显示Ghrelin免疫阳性细胞主要分布在支气管上皮,细胞核与细胞质均呈阳性。其表达丰度在正常对照组和CDH组都是随着胎龄的增加而减少,在我们所研究的3个胎肺发育时段(17.5,19.5,21.5天胎龄)CDI{组的表达丰度均较对照组高。Dex治疗组的表达丰度高于正常对照组低于CDH组。 结论: 1.Ghrelin在正常大鼠不同发育时期胎肺中的表达水平不同。Ghrelin在胎肺中的表达量与胎肺发育的成熟度有关。在胎肺发育早期(大鼠15.5天胎龄,相当于肺发育的假腺管期)其表达水平较高,随胎龄增加胎肺逐渐发育成熟其表达量下降。 2.Ghrelin在CDH大鼠不同发育时期胎肺中的表达曲线与对照组的相似,但其表达量较同龄正常大鼠明显增高,特别在出生前其表达量仍较对照组高。可能是CCH组胎肺发育滞留在不成熟期的原因造成的,与CDll大鼠胎肺中神经内分泌细胞的数量增加有关。 3.Dex可下调Ghrelin在CDH大鼠胎肺中的表达水平,结合上述结论推测,这可能是因为Dex促进了胎肺的发育成熟而引起的,但其机制尚待进一步研究。 4.Ghrelin 在胎肺中的表达水平高是胎肺发育较早期不成熟表现,其表达水平可以作为评价胎肺成熟度的指标。
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