近年来介导碳青霉烯耐药的blaNDM基因、介导多粘菌素耐药mcr基因以及介导替加环素高水平耐药基因tet（X4）的发现及广泛传播,严重削弱了临床上“最后一道防线”抗生素的有效性。而目前有关这三种重要耐药基因中的两种存在于同一菌株的报道频现,根据其传播规律,可能会出现集三个重要耐药基因于一体的超级细菌,该类细菌的流行将使得人类陷入无药可用的境地。耐药基因在宿主菌中的适应性,是评估其是否能广泛传播的重要指标。本文将携带tet（X4）阳性可接合质粒通过接合转移方式转入临床分离的携带blaNDM-5和mcr-1的多重耐药大肠杆菌N31中,通过测定接合子CN31-pF65-tet（X4）在非选择压力和选择压力（替加环素,2μg/mL）下传代100代过程中的质粒稳定性、竞争性、生长速度等进行适应性评价,同时通过比对传代前后菌株（进化和祖代菌株）的相关特性,分析菌株在非选择压力和选择压力传代进化过程中的进化规律和进化模式,以期探索tet（X4）阳性质粒在多重耐药菌中的适应性、质粒稳定性及其进化机制,评估同时携带这三种重要耐药基因细菌出现的可能性。将接合子CN31-pF65-tet（X4）在非选择和选择压力下进化100代,测定在不同条件的传代过程中目标质粒及tet（X4）基因的稳定性。结果表明tet（X4）质粒在阳性选择中稳定存在,在非阳性选择中逐渐丢失;生长动力学和间接竞争试验发现,质粒的转入对宿主菌造成了一定的适应性代价,但通过不同条件的进化过程,其适应性代价得到改善。为了进一步研究其进化规律,从两种条件传代100代群体中随机挑选了 5个携带tet（X4）阳性质粒的进化菌株进行后续研究。通过测定质粒及tet（X4）丢失率,接合频率以及耐药水平的变化来比较进化菌株和祖代菌株的相关特性。非选择进化菌株（5/5）和选择性进化菌株（3/5）其质粒丢失率在25%以下,质粒稳定性提升;非选择进化菌株的tet（X4）稳定存在,而选择性进化菌株其tet（X4）丢失率为90%-100%,表明两种条件传代的进化菌株通过不同进化模式提升质粒稳定性。接合频率结果显示,进化菌株中tet（X4）阳性质粒和blaNDM-5阳性质粒的接合频率相较于祖代质粒均得到了极显著提高（P＜0.0001）。接合转移有关的接合调控因子traJ、traY、traM及traI表达水平上调,促进下游接合转移有关tra基因的转录,使得接合频率提升。通过对非选择性和选择性进化菌株的耐药水平测定发现非选择性进化菌株对替加环素的耐药水平下降（MIC=8 μg/mL）,而选择性进化菌株对其耐药水平上升（MIC=16μg/mL）。另一方面,对tet（X4）表达水平测定中发现选择性进化菌株的表达水平相对于祖代菌株提高了 20倍以上（P＜0.0001）,而非选择进化菌株其表达水平相较于祖代菌株下降。结合质粒及tet（X4）丢失率结果表明,tet（X4）表达水平的提高增强了对替加环素的耐药水平,而高表达的tet（X4）基因在传代过程中逐渐丢失,低表达的tet（X4）基因可稳定留存。对进化前后菌株进行全基因组测序分析发现,进化质粒中编码与接合转移有关基因产生了大量突变。同时,非选择（2/3）和选择性进化菌株（2/3）在染色体基因组中发生了klcA突变,该突变的产生可能会促进DNA转移,这些突变可能与质粒的接合频率的提升有关。此外,在选择性进化菌株的染色体基因组中,产生了MarR突变,该基因的突变可能会促进多药耐药外排泵对四环素类药物的抗性,这与选择性进化菌株的耐药水平提升可能具有一定的关联。对进化前后质粒进行纳米孔测序分析发现,相较于祖代质粒,进化质粒均丢失了 43kb的多重耐药区域,提高了质粒的稳定性。以上数据分析提示质粒-宿主共进化促进了进化菌株表型的改变。为进一步验证质粒稳定性提升的进化模式,将进化前后质粒转入TOP10工程菌比较其适应性及稳定性变化,同时构建祖代质粒-进化菌株。在TOP10中非选择和选择性进化质粒稳定性、接合频率及tet（X4）保留率均显著高于祖代质粒。而选择性进化质粒的适应性代价高于非选择进化质粒,进一步表明高表达的tet（X4）增强质粒的适应性代价。此外,祖代质粒在选择性进化菌株的稳定性及接合频率均显著提高。上述研究证明了质粒-宿主的共进化模式。本文通过研究非选择和选择性进化条件下,同时携带blaNDM-5、mcr-1和tet（X4）菌株的表型及基因型变化,发现非选择进化条件下,进化菌株可以通过提高其接合频率,降低耐药基因表达水平,丢失多重耐药片段来提高其质粒稳定性以及tet（X4）基因的稳定性。以上的研究为进一步的探索多重耐药细菌的形成及耐药性的传播提供理论依据。