肠出血性大肠杆菌O157:H7是一种食源性病原体,常在宿主的胃肠道内定植并引起疾病,如出血性结肠炎（HC,hemorrhagic colitis）和溶血性尿毒综合征（HUS,Hemolytic uremic syndrome）,严重危害人类的生命健康。在此类致病性大肠杆菌进入胃肠消化道时,宿主胃内酸性环境是对其设置的一道天然屏障。EHEC O157:H7具有较强耐酸性,通过激活复杂的耐酸调节网络,其能够耐受pH 2.5或更低pH值的酸性条件数小时,以穿过酸性环境进入肠道。群体感应（QS,Quorum sensing）是细菌中一种依赖种群密度的细胞间信号通讯机制,AHL（Acyl-homoserine lactones）是细菌Ⅰ型群体感应系统信号分子。大肠杆菌缺乏LuxI而无法自身合成AHLs,却可以编码AHL的受体——LuxR家族的转录因子SdiA,因此可以“群体感应窃听”其他细菌产生的AHLs并在群体规模上作出应答。本实验室前期研究发现,对比其他短链AHLs（C4-HSL和C6-HSL）,3-碳位置有特异性基团的3-oxo-C6-HSL对EHEC EDL933酸耐受能力的提升更显著。而本研究则锚定Ⅰ型群体感应系统调控大肠杆菌耐酸性的机制,进一步阐明其作用机理。具体研究内容如下:1.基于RNA-seq技术筛选QS调控EHEC耐酸性的主要差异表达基因实验室前期研究表明,100μM的AHL分子3-oxo-C6-HSL显著提高肠出血性大肠杆菌O157:H7在强酸条件下的存活能力,因此本研究采用浓度为100 μM的3-oxo-C6-HSL对O157:H7 EDL933菌株进行刺激,利用RNA-seq技术筛选在pH 2.5酸性条件下,细菌经群体感应刺激后的差异表达基因。转录组结果表明,与对照组相比,AHL组有36个基因显著上调,47个基因显著下调。GO富集分析和KEGG富集分析表明差异表达基因主要富集在核糖体通路,其中核糖体调节因子编码基因rmf（ribosome modulation factor）和核糖体抑制因子编码基因 raiA（ribosome-associated inhibitor A）上调,rpsL、rpsT、rpsJ、rplM、rplY等核糖体蛋白相关编码基因下调。rmf和raiA在核糖体冬眠过程中都发挥重要作用,但rmf的作用更广泛且上调倍数最高（2.9倍）,因此选择rmf基因进行后续研究。本研究为接下来进一步探索细菌群体感应分子调控O157:H7 EDL933菌株的耐酸机制奠定基础。2.大肠杆菌Δrmf缺失株的构建及rmf调控大肠杆菌多种应激反应验证差异表达基因中核糖体调节因子rmf基因的上调倍数最显著,因此选择rmf基因作为靶标基因进行后续的研究。在胁迫条件下,RMF结合两个70S核糖体并改变30S亚基的构象,促进核糖体二聚化形成无活性100S核糖体,这是细菌重要的生存策略。本研究构建了肠出血性大肠杆菌O157:H7 EDL933 Δrmf缺失株、肠道外禽致病性大肠杆菌 APEC TW-XM Δrmf缺失株、EDL933 Δrmflprmf回补株以及 TW-XM Δrmflprmf回补株,探究了 RMF在酸应激、冷应激、热应激、饥饿应激、氧化应激中的调控作用。研究结果显示,饥饿应激处理后,相比于野生株,EDL933 Δrmf缺失株存活率下降13.7倍,TW-XM Δrmf缺失株下降5.2倍;冷应激（-20℃）处理后,相比于野生株,EDL933 Δrmf缺失株存活率下降8.7倍,TW-XM Δrmf缺失株下降5.7倍;热应激（50℃）处理后,相比于野生株,EDL933 Δrmf缺失株存活率下降7.0倍,TW-XMΔrmf缺失株下降5.0倍;添加5mmol/L的H2O2作为氧化应激条件测定生长曲线,相比于野生株,Δrmf缺失株受到的抑制作用更强,第9 h,Δrmf缺失株的OD600仅为EDL933和TW-XM野生株的50%和40%;酸应激（pH 2.5）处理后,相比于野生株,EDL933 Δrmf缺失株存活率下降9.0倍,TW-XMΔrmf缺失株下降5.0倍。综上,RMF对于EDL933和TW-XM菌株抵抗饥饿应激、冷应激、热应激、氧化应激以及酸应激发挥重要作用。3.EHEC介导群体感应信号分子AHL和rmf基因调控耐酸性本研究在确定了群体感应信号分子AHL上调rmf基因表达的基础上,进一步探究rmf基因参与调控大肠杆菌EHEC耐酸性的耐酸机制。首先验证外源性及内源性AHL分别刺激下大肠杆菌耐酸性变化。耐酸实验表明外源添加AHL可以增强O157:H7 EDL933 的耐酸能力,相比于添加 10 μM 的 3-oxo-C6-HSL,100 μM 3-oxo-C6-HSL对EDL933酸应答能力的提升效果更显著。将耶尔森菌的yenI基因导入EDL933菌株,赋予其合成短链AHL的能力,耐酸实验显示内源产AHL同样可以增强O157:H7 EDL933的酸应答能力。随后选取培养至稳定生长阶段的野生株、Δrmf缺失株、Δrmflprmf回补株进行耐酸实验,结果表明Δrmf缺失株在pH 2.5条件下的存活率相比于野生株下降8倍,但回补株的耐酸性有所回复,这是首次发现rmf参与O157:H7 EDL933的耐酸过程。荧光定量PCR结果显示rmf通过调控谷氨酸耐酸系统基因（gadA、gadC、gadW、gadE）、精氨酸耐酸系统基因（adiA）、分子伴侣（hdeA、hdeB）的表达,来增强EHEC EDL933菌株对强酸环境的耐受性。此外,AHL通过SdiA受体途径调控rmf基因的表达,并且这种调控作用只在酸应激条件下才被激活;在强酸环境中rmf对rpoS、sdiA都发挥显著调控作用,因此,sdi4、rpoS、rmf三者在抵抗酸胁迫过程中存在相互调控作用,这也是rmf参与调控大肠杆菌耐酸性的通路之一。综上所述,群体感应信号分子AHL通过调控核糖体调节因子RMF来调节多种耐酸相关基因的表达以增强其耐酸性,且rmf基因也影响大肠杆菌在多种应激条件下的生存能力。本研究结果为进一步完善大肠杆菌的压力应答机制奠定了基础。