【摘 要】
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血清4型禽腺病毒（Serotype 4 Fowl Adenovirus,FAdV-4）目前在世界范围内广泛流行,感染后可引发鸡的肝炎-心包积液综合征,以发生肝炎、肾炎并伴有心包积液为主要的临床症状。FAdV-4感染后具有潜伏期短、发病快和死亡率高等特点,对鸡群的致死率可高达80%。由FAdV-4感染引起的肝炎-心包积液综合征自2015年开始席卷我国多个省市地区,呈大规模爆发,对我国家禽养殖行业造成
【基金项目】
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江苏省农业科技自主创新资金项目（编号:CX（19）3026）； 扬州市科技计划（现代农业）重点研发项目（编号:YZ2020051）；
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血清4型禽腺病毒（Serotype 4 Fowl Adenovirus,FAdV-4）目前在世界范围内广泛流行,感染后可引发鸡的肝炎-心包积液综合征,以发生肝炎、肾炎并伴有心包积液为主要的临床症状。FAdV-4感染后具有潜伏期短、发病快和死亡率高等特点,对鸡群的致死率可高达80%。由FAdV-4感染引起的肝炎-心包积液综合征自2015年开始席卷我国多个省市地区,呈大规模爆发,对我国家禽养殖行业造成了巨大的经济损失。然而目前国内针对该病毒的商品化疫苗仅有2021年才获批的2款新城疫-禽流感（H9N2）-禽腺病毒（I群,4型）病三联传统灭活疫苗,尚无获批的FAdV-4弱毒活疫苗。最近,Xie等靶向编辑FAdV-4毒力因子Fiber-2构建了 EGFP与Fiber-2融合,部分Fiber-2序列缺失以及EGFP完全替换Fiber-2的三株致弱的重组FAdV-4病毒。为靶向FAdV-4的另外一个Fiber,即Fiber-1,探究其能否也被编辑构建成弱毒FAdV-4病毒,本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对病毒的Fiber-1进行了编辑,构建了一种新型的稳定表达红色荧光RFP与Fiber-1蛋白融合的重组FAdV-4,且在体内外对其进行了生物学特性的测定。1.表达红色荧光蛋白的重组血清4型禽腺病毒的构建为了探究能否对FAdV-4病毒的Fiber-1进行靶向编辑构建重组病毒,本研究将RFP作为外源基因插入到Fiber-1中,尝试构建一株可以表达红色荧光蛋白的重组FAdV-4。本研究首先将RFP基因置于Fiber-1杆部和尾部的连接处,前后分别设计同源臂,构建拯救重组病毒所用的供体质粒。随即利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,在LMH细胞转染sgRNA以及感染野生型FAdV-4后再转染供体质粒进行病毒拯救。对出现的红色荧光病毒斑在LMH细胞中通过有限稀释法以及空斑法连续纯化,且对纯化的重组病毒进行测序和Western Blot鉴定。结果表明本研究成功获得了高纯度的表达RFP的重组FAdV-4病毒,命名为FAdV4-RFPF1。虽然重组病毒FAdV4-RFPF1在体外的复制能力较野生型FAdV-4弱,但FAdV4-RFPF1仍然可以在LMH细胞中进行高效复制,且发现FAdV4-RFPF1能够在体外稳定传代。以上表达RFP与Fiber-1融合蛋白的重组病毒FAdV4-RFPF1的成功构建,证明FAdV-4的Fiber-1同样可以作为靶基因进行编辑构建重组禽腺病毒,为进一步开发基于FAdV-4的新型基因工程疫苗打下了基础。2.重组禽腺病毒FAdV4-RFPF1的致病性及其免疫保护效果为了进一步评价重组病毒FAdV4-RFPF1在鸡体内的复制能力、致病性及其对野毒的免疫保护效果,本研究开展了 FAdV4-RFPF1在SPF鸡体内的感染性试验。分别将相同剂量的重组病毒FAdV4-RFPF1、野生型FAdV-4病毒接种3周龄的SPF鸡,同时设立不感染阴性对照组鸡。每日观察和记录感染鸡群临床症状,且在不同时间点采集鸡群泄殖腔拭子以及肝、脾、肾脏器进行病毒分离滴定,采集血清进行中和抗体测定。结果发现重组病毒FAdV4-RFPF1对SPF鸡高度致弱,感染鸡群未出现任何临床发病症状,且泄殖腔不排毒、组织脏器也分离不到病毒。然而,重组病毒FAdV4-RFPF1可以有效刺激机体产生针对FAdV-4的高水平中和抗体。在感染21天后,对重组病毒FAdV4-RFPF1感染鸡群进行致死剂量FAdV-4攻毒保护试验。结果发现感染FAdV4-RFPF1的鸡群能够阻断病毒排毒及组织脏器的带毒,对高致病性FAdV-4提供100%保护。以上结果证明重组病毒FAdV4-RFPF1高度致弱,且能对高致病性FAdV-4提供有效保护,为进一步开发基于Fiber-1的重组FAdV-4致弱的基因工程多价或多联疫苗提供了技术支撑。
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