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目的体外诱导小鼠胚胎干细胞SF1-G定向诱导分化为胰岛样细胞,观察诱导分化培养过程中印记基因Kcnq1、Cdknlc印记变化,探讨胚胎干细胞体外诱导分化培养过程中表观遗传学的稳定性。方法1.从孕小鼠胚胎分离培养小鼠胚胎成纤维细胞,丝裂霉素C处理第3-5代小鼠胚胎成纤维细胞制备饲养层细胞,在饲养层细胞上扩增培养小鼠胚胎干细胞株SF1-G细胞。2.参照Shi等人的三阶段法,定向诱导小鼠胚胎干细胞SF1-G向胰岛样细胞分化；细胞免疫荧光染色和RT-PCR检测分化细胞中胰岛细胞特异性标志物的表达。3.在诱导分化培养的不同阶段收集细胞,逆转录-聚合酶链式反应／限制性内切酶片段长度多态性(RT-PCR/RFLP)检测印记基因Kcnq1、Cdknlc表达的亲本来源,分析其印记状态。结果1.SF1-G细胞能在饲养层细胞上保持未分化状态增殖培养。2.RT-PCR结果显示,在诱导分化的第三阶段,细胞逐渐出现胰岛细胞特异性基因的表达；细胞免疫荧光结果显示,分化终末细胞可表达胰岛细胞特异性激素蛋白,证实成功将胚胎干细胞诱导分化为胰岛样细胞。3.RT-PCR/RFLP分析结果显示,诱导分化后的细胞印记基因Kcnq1、Cdknlc从母源单等位基因表达转变成双等位基因表达,出现印记丢失(LOI),而持续传代培养的ES细胞中Kcnq1、Cdknlc仍表现为母源单等位基因表达,即印记保持(MOI)。结论1.参照Shi等人的方法,我们能将小鼠胚胎干细胞体外定向诱导培养分化为胰岛样细胞。2.是诱导分化培养作用,而不是单纯的细胞传代培养过程导致印记基因表达异常,出现印记丢失,即细胞诱导分化培养过程导致了表观遗传性状的不稳定。目的观察胚胎干细胞SF1-G在诱导分化前后印记基因Kcnq1、Cdknlc印记调控区(ICR)差异性DNA甲基化区KvDMR1的甲基化状态,以及分化各阶段细胞中DNA甲基转移酶水平变化,以探讨胚胎干细胞在体外诱导分化培养过程中印记基因Kcnq1、Cdknlc表达变化的机理。方法1.重亚硫酸盐PCR测序法检测分化前后Kcnq1、Cdknlc基因印记调控区KvDMR1的CpG位点甲基化状态：1)收集未分化的细胞及诱导分化终末的细胞,提取基因组DNA,重亚硫酸盐处理DNA,以特异性引物PCR扩增差异性DNA甲基化区KvDMR1;2)将PCR产物连接到氨苄抗性T载体质粒后转入感受态细菌,用不含氨苄的LB培养基摇菌后均匀涂在氨苄琼脂糖平板上,次日挑取阳性细菌克隆,用含氨苄的LB培养基筛选阳性细菌；3)PCR验证细菌中存在目的片段后,将菌液送送上海生工生物工程公司测序,测序结果通过软件进行分析,了解分化前后细胞的KvDMR1的甲基化状态。2. Western blot检测诱导分化各阶段细胞中DNA甲基转移酶Dmnt1和Dmnt3b的表达水平。结果1.测序检测了KvDMR1区23个CpG位点的甲基化状态,在分化前的胚胎干细胞中,9个测序结果显示,有4个表现为1-23个CpG位点全部甲基化,另外5个表现为所有CpG位点都未甲基化,即KvDMR1区的CpG位点表现为全甲基化或全未甲基化,符合印记调控区域差异性DNA甲基化区(DMR)的特点；而在分化后的细胞中,11个测序结果显示,其中5个表现为1-23个CpG位点全部甲基化,4个在第18-23个CpG位点发生甲基化,而其余CpG位点未甲基化,其余2个表现为所有CpG位点都未甲基化,提示原来未甲基化的KvDMR1发生了甲基化。2. Western blot结果显示,胚胎干细胞诱导分化后,从第二阶段开始DNA甲基转移酶Dmnt1水平显著升高；DNA甲基转移酶Dmnt3b在第三阶段也显著升高,而同期传代培养的未分化细胞DNA甲基转移酶水平没有明显变化。结论1.诱导分化过程中印记调控区域的差异性DNA甲基化区KvDMR1的第18-23个CpG位点甲基化状态的改变可能与印记基因Kcnq1、Cdknlc的印记丢失相关。2.诱导分化过程中DNA甲基转移酶水平升高,可能介导了KvDMR1区甲基化状态的改变,最终引起基因印记状态发生改变,导致印记丢失。