免疫检查点阻断（Immune Checkpoint Blockade,ICB）是癌症治疗的一种突破性免疫疗法,其通过重振免疫系统的细胞毒性潜力而起作用。然而,目前ICB的临床疗效仍然非常有限,大多数实体瘤患者对这种疗法反应较差。越来越多的研究揭示了ICB主要的耐药机制,包括肿瘤免疫原性不足、免疫抑制和T细胞活化不足。研究表明,肿瘤微环境（Tumor Microenvironment,TME）内预存的抗肿瘤CD8+T细胞越多,则肿瘤对基于PD1的ICB疗法越敏感。在接受anti-PD1治疗的黑色素瘤患者中,治疗前活检标本中存在的T细胞越多,疗效越好,而且肿瘤边缘CD8+T细胞密度的高低,可以预测患者对疗法的反应性,这表明肿瘤内T细胞浸润与ICB治疗敏感性之间存在正相关关系。先前的研究表明,实体瘤缺乏免疫原性是其对ICB治疗缺乏敏感性的主要原因,但怎样提高实体瘤的免疫原性,目前在很大程度上仍然是未知的。最近临床上越来越提倡将肿瘤分为“热”肿瘤和“冷”肿瘤,作为ICB临床应用的辅助手段。“冷”肿瘤,如前列腺癌和结肠癌,由于其免疫原性低,对单独ICB治疗反应较差。因此近年来,临床上已采用联合疗法将“冷”肿瘤转化为“热”肿瘤,以提高免疫疗法的疗效,这种联合疗法包括化疗或放疗联合免疫疗法。化疗和放疗主要通过阻断细胞分裂或破坏线粒体导致肿瘤细胞凋亡。然而,细胞凋亡是一种免疫原性较差的生理性细胞死亡。因此,找到新的联合疗法以提高ICB的疗效至关重要。用脂质微米气泡（Microbubble,MB）封装惰性气体,这种材料最初是用作低功率超声（Ultrasound,US）成像的造影剂。然而研究表明,US刺激MB产生的空化效应可以促进肿瘤灌注,从而增加CD8+T细胞的肿瘤浸润并增强MC38动物肿瘤模型中ICB的疗效。但肿瘤血管中内皮细胞之间的间隙小于2μm,因此MB只能少量的进入TME,导致它们在增强肿瘤免疫原性中的应用仍然十分有限。与MB相比,纳米气泡（Nanobubble,NB）可以很容易地穿过肿瘤内的血管内皮并积聚在肿瘤内部。此外,我们前面的研究证明,即使超声波功率较大,破坏NB产生的空化效应也只会产生少量的热量。有研究显示,携带Ce6（一种声敏材料）的NB在超声激发下诱导ROS（Reactive Oxygen Species）生成抑制癌细胞生长,从而与PD1阻断疗法达到协同作用;然而,超声刺激纳米气泡（USNB）对肿瘤免疫微环境的影响及其对肿瘤免疫原性的影响在很大程度上仍然难以确定。本研究首次揭示了USNB能够有效地将部分“冷”肿瘤转化为“热”肿瘤,从而与anti-PD1疗法产生协同作用。最重要的是,本研究证明了USNB可以显著增加“冷”肿瘤的免疫原性,并极大的促进损伤相关分子模式（DAMPs）的释放,以激活TME和引流淋巴结（d LN）中的炎症反应,从而增强全身抗肿瘤免疫和免疫记忆,并长期抑制肿瘤的生长和复发。1.USNB协同提高anti-PD1治疗的疗效1.1方法1.1.1利用小鼠结肠癌细胞MC38、前列腺癌细胞RM1以及黑色素瘤细胞B16建立小鼠肿瘤模型:对照组（untreated）、单独anti-PD1治疗组（anti-PD1）、单独USNB治疗组（USNB）、联合治疗组（USNB+anti-PD1）,分组治疗,每组10只,比较不同治疗组之间肿瘤生长速度、小鼠生存期,验证USNB协同增强anti-PD1治疗的效果。1.1.2通过流式细胞学检测各治疗组小鼠TME、d LN以及脾脏内CD44+CD8+T细胞、CD4+T细胞、Th1细胞、Treg细胞的数量和比例并加以比较,验证USNB对淋巴细胞肿瘤浸润以及全身系统性免疫的影响。1.1.3利用细胞清除抗体清除小鼠体内的淋巴细胞后建立肿瘤模型并进行USNB治疗,根据清除细胞的种类不同将小鼠分组:USNB+αCD4,USNB+αCD8,USNB+αCD4+αCD8,USNB+αNK和USNB,每组10只,验证在USNB治疗中起主要作用的淋巴细胞。1.2结果1.2.1在MC38、RM1、B16三种肿瘤模型中,单独anti-PD1治疗无法取得明显疗效,单独USNB治疗即可抑制肿瘤生长,二者联合治疗则显示出更加明显的肿瘤抑制效应,而且USNB+anti-PD1治疗可以显著延长小鼠的生存期。1.2.2 USNB+anti-PD1组TME、d LN以及脾脏中CD44+CD8+T细胞数量均明显高于untreated组和anti-PD1组,anti-PD1组d LN以及脾脏中CD44+CD8+T细胞数量高于untreated组,但肿瘤内未明显增多。1.2.3在不同的治疗组中,CD4+T细胞、Th1细胞以及Treg细胞的数量未见明显差别。1.2.4细胞清除实验中,USNB+αCD4+αCD8和USNB+αCD8组肿瘤生长速度最快,USNB+αCD4和USNB+αNK组中等,USNB组最慢。1.3结论1.3.1 USNB治疗可以协同提高anti-PD1治疗的疗效。1.3.2 USNB治疗可以促进CD8+T细胞向肿瘤内浸润和提高全身系统性T细胞免疫。1.3.3 USNB的治疗作用主要依赖CD8+T细胞。2.USNB赋予CD8+T细胞治疗“冷”肿瘤的能力2.1方法2.1.1利用RM1、MC38细胞建立小鼠肿瘤模型,分组同前。2.1.2通过流式细胞学检测并比较各治疗组TME内GZMB+CD8+T细胞、CD107+CD8+T细胞、IFNγ+CD8+T细胞的数量以及各组CD44+CD8+T细胞内GZMB、CD107、IFNγ以及KLRG1的MFI（平均荧光强度）以及Tbet表达水平,验证USNB增强肿瘤内CD8+T细胞杀伤能力的效果。2.1.3通过流式细胞学检测各治疗组TME内PD1+Tim3+CD8+T细胞的数量以及PD1、Tim3的MFI,验证USNB+anti-PD1减少CD8+T细胞在肿瘤内耗竭的效果。2.2结果2.2.1 USNB+anti-PD1组TME内GZMB+CD8+T细胞、CD107+CD8+T细胞、IFNγ+CD8+T细胞的数量明显高于其他组。2.2.2 USNB+anti-PD1组CD44+CD8+T细胞内GZMB、CD107、IFNγ以及KLRG1的MFI以及Tbet表达水平明显高于其他组。2.2.3 USNB+anti-PD1组TME内PD1+Tim3+CD8+T细胞的数量以及PD1、Tim3的MFI较其他组明显降低。2.3结论2.3.1 USNB治疗可以显著增强TME内CD8+T细胞的杀伤效能,从而进一步增强anti-PD1的治疗效果。2.3.2 USNB+anti-PD1治疗可以显著减轻CD8+T细胞在肿瘤内的耗竭。3.USNB通过促进肿瘤抗原和DAMPs的释放促进免疫应答3.1方法3.1.1利用RM1、MC38细胞建立小鼠肿瘤模型,分组同前。3.1.2通过流式细胞学检测在USNB治疗后不同时间点（Day1,Day4）TME和d LN内抗原递呈细胞（APC）的变化,包括CD11c+（树突状细胞）,CD68+（巨噬细胞）,CD11b+（单核细胞）,CD45+（白细胞）以及CD49b+（NK细胞）,验证CD8+T细胞浸润和功能增强是否由APC介导的CD8+T细胞活化所导致。3.1.3体外培养RM1-OVA细胞,分为4组进行不同治疗:NB,US,USNB和untreated,取上清通过Western blot检测各组DAMPs（包括ATP、HMGB1、Calreticulin以及HSPA2）以及OVA蛋白的含量,并利用电子透射显微镜观察各组治疗前后细胞形态的改变,RM1-OVA细胞经过USNB治疗后通过线粒体染料（Mito Tracker）和核酸染料（7AAD）染色,在共聚焦显微镜下观察,验证USNB治疗促进肿瘤抗原以及DAMPs的释放的效果。3.1.4体外培养RM1-OVA细胞,分为4组进行不同治疗（分组同前）,取上清与脾细胞共培养,然后通过流式细胞学检测各组CD8+T细胞的活化程度与杀伤效能,验证USNB治疗导致的肿瘤抗原以及DAMPs的释放对CD8+T细胞免疫效能的影响。3.1.5通过转录组测序验证USNB治疗在转录水平促进抗原层递、CD8+T细胞活化以及增强anti-PD1疗效的能力。3.2结果3.2.1 USNB和USNB+anti-PD1组在治疗后第1天（Day1）和第4天（Day4）TME中树突状细胞、巨噬细胞、单核细胞、白细胞以及NK细胞均增多。3.2.2 USNB和USNB+anti-PD1组在治疗后第1天d LN中树突状细胞、巨噬细胞以及单核细胞增多,第4天各组未见明显异常。3.2.3 USNB组上清中的OVA、ATP、HMGB1、Calreticulin以及HSPA2蛋白含量明显高于其他组。3.2.4电子透射显微镜显示USNB治疗后肿瘤细胞膜不完整,线粒体肿胀,细胞核碎裂,细胞内容物泄露至胞外,单独US或NB治疗组细胞形态未见明显异常。3.2.5共聚焦显微镜显示USNB治疗后肿瘤细胞形态明显改变,镜下可见大量结合了7AAD的细胞核碎片以及泄露至胞外的被Mito Tracker染色的线粒体,其他组细胞形态正常。3.2.6共培养后,USNB组CD8+T细胞PD1、CD69、CD25、TNFα以及IFNγ表达水平较其他组明显增高。3.2.7转录组测序结果显示,USNB治疗后TME中“急性炎症反应”、“细胞死亡”以及“对创伤和刺激的反应”通路表达水平升高,USNB+anti-PD1组“免疫反应”、“T细胞活化”以及“抗原加工呈递”通路表达水平升高。3.3结论3.3.1 USNB治疗后TME中CD8+T细胞浸润增加和功能增强是由APC介导的CD8+T细胞活化导致的。3.3.2 USNB治疗可以促进肿瘤抗原以及DAMPs的释放以提高CD8+T细胞的活化程度与杀伤效能,从而增强anti-PD1治疗的疗效。4.USNB治疗诱导的肿瘤细胞坏死促进肿瘤抗原和DAMPs的释放4.1方法4.1.1将纳米气泡染色后与肿瘤细胞共培养,通过共聚焦显微镜观察细胞摄取情况。4.1.2体外培养RM1细胞并分为4组进行不同治疗:NB,US,USNB和untreated,治疗后0h、24h显微镜下观察细胞形态及生长状况,治疗后0h、4h用7AAD、annexin V和Caspase3染色细胞,通过流式细胞仪检测细胞凋亡信号,治疗后4h流式检测胞内ROS水平,用CFSE标记RM1细胞并分为4组（分组同前）进行不同治疗,24h后流式检测细胞增殖状况,评估USNB治疗在体外导致肿瘤细胞坏死的情况。4.1.3利用RM1、MC38建立小鼠肿瘤模型（分组同前）,治疗后取肿瘤组织固定包埋并进行HE染色,显微镜下观察组织坏死情况,评估USNB治疗在体内导致肿瘤细胞坏死的情况。4.2结果4.2.1纳米气泡加入培养基后可被RM1和MC38细胞摄取,并在胞内保持稳定。4.2.2 USNB治疗后,显微镜下可见大量细胞碎片,治疗后24h镜下可见US、NB和untreated组细胞重新贴壁继续增殖,USNB组细胞仍然保持悬浮、碎裂的状态。4.2.3治疗后0h,USNB组annexin V-7AAD+的细胞比例约为65%,其他组低于1%,治疗后4h,USNB组annexin V-7AAD+的细胞比例降至7.84%,annexin V+7AAD+的细胞比例升至21.8%。4.2.4治疗后0h,各组Caspase3、ROS表达水平类似,治疗后4h,USNB组Caspase3表达水平升高43.3%,ROS表达水平也明显升高,其他组较0h变化不大。4.2.5流式检测CFSE显示,治疗后24h USNB组细胞未见增殖,其他组细胞正常增殖。4.2.6 HE染色显示,USNB治疗后肿瘤组织出现大面积坏死,其他组则只有少量坏死。4.3结论在体内外,USNB介导的空化效应引起的机械力可以导致肿瘤细胞立即分解坏死,从而促进释放肿瘤抗原和DAMPs。5.USNB联合anti-PD1疗法增强全身系统性抗肿瘤免疫并建立免疫记忆5.1方法5.1.1利用RM1、MC38建立小鼠转移瘤模型（双侧腿同时或一侧腿和肺部同时植入肿瘤）,分组同前,治疗单侧腿部肿瘤,观察双侧腿部肿瘤生长趋势或肺部转移瘤数量,验证USNB+anti-PD1治疗增强全身系统性抗肿瘤免疫以及抑制转移瘤生长的效果。5.1.2用USNB+anti-PD1治疗皮下种植MC38肿瘤的小鼠至完全缓解（CR）,60天后再次皮下种植MC38肿瘤（Rechallenge）,观察肿瘤生长趋势,验证USNB+anti-PD1治疗肿瘤后机体能否产生免疫记忆。5.2结果5.2.1双侧腿部肿瘤（治疗测和未治疗测）生长趋势均与之前类似:USNB+antiPD1治疗可以显著抑制肿瘤生长;USNB+anti-PD1治疗单侧腿部肿瘤,也可以显著减少肺转移结节的数量。5.2.2 Rechallenge实验中,再次种植的肿瘤被完全清除。5.3结论5.3.1 USNB+anti-PD1治疗可以增强全身系统性抗肿瘤免疫从而减少转移灶的形成并抑制转移瘤的生长。5.3.2 USNB+anti-PD1治疗肿瘤后机体产生免疫记忆从而获得长期免疫保护。