论文部分内容阅读
植物甜蛋白是指从植物中分离得到的具有甜味的小分子蛋白质。目前发现的植物甜蛋白有6种，其中MabinlinⅡ是从产于我国云南省的植物马槟榔(Capparis masaikaiLvl.)的种子中分离得到的，而Brazzein是从非洲西部野生植物Pentadiplandrabrazzeana Baillon的果实中分离提纯的。这两种甜蛋白具有分子量小，甜度高，热稳定性强的特点，具备成为商品化高甜味剂的潜力。
本研究旨在通过分子生物学研究及基因重组技术在微生物细胞异源表达上述两种植物甜蛋白，为规模化生产打下基础。
首先，我们通过RT-PCR从马槟榔叶片中扩增得到MabinlinⅡ的全长cDNA，并以此cDNA为模板，扩增得到可以在大肠杆菌(Escherichia coli)和乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)中表达的MabBH和MabNS序列。之后，将MabBH和MabNS序列分别克隆入表达载体pET43.1a和pNZ8048，并分别转化表达宿主菌E.coliBL21(DE3)和L.lactis NZ9000中，成功构建出两株MabinlinⅡ的重组表达菌E. coliBL21(DE3)/pET43.1a-MabBH(简称B/MabBH)和L.lactis NZ9000/pNZ8048-MabNS(简称N/MabNS)。同时根据Brazzein的氨基酸序列以及大肠杆菌和乳酸乳球菌的密码子偏爱性，设计并合成了用于在大肠杆菌和乳酸乳球菌中表达的BraBH和BraNS序列。将BraBH和BraNS序列分别克隆入表达载体pET43.1a和pNZ8048，并分别转化表达宿主菌E.coli BL21(DE3)和L.lactis NZ9000中，成功构建出两株Brazzein的重组表达菌：E.coli BL21(DE3)/pET43.1a-BraBH(简称B/BraBH)和L.lactisNZ9000/pNZ8048-BraNS(简称N/BraNS)。
用IPTG诱导B/MabBH和B/BraBH表达重组甜蛋白，SDS-PAGE检测到了两种重组甜蛋白条带，即重组MarbinlinⅡ和重组Brazzein，初步的甜味测定结果证实两种重组甜蛋白具有类似于天然甜蛋白的甜味特征。同时利用重组蛋白上的His-Tag对蛋白进行进一步的纯化和Western Blotting鉴定。结果表明，两种重组蛋白经镍柱纯化可以得到单一电泳条带的样品，并且Western Blotting成功检测到目的蛋白。
对重组表达菌B/MabBH和B/BraBH进行了IPTG诱导表达条件的优化，实验结果表明，B/MabBH的最佳表达条件为在培养液的OD600为0.6时，加入1.25mmol/L的IPTG，37℃诱导10小时，表达的甜蛋白量可达总蛋白的30％以上；B/BraBH的最佳表达条件是在培养液的OD600为1.0时，加入0.75mmol/L的IPTG，30℃诱导10小时，表达的甜蛋白量可达总蛋白的55%以上。
本研究通过基因工程技术分别将MabinlinⅡ和Brazzein基因片段克隆入大肠杆菌高效表达载体pET43.1a，利用该质粒上的Nus-Tag融合蛋白标签，促进外源表达的甜蛋白形成正确的高级结构，取得具有天然甜味的重组表达甜蛋白。另外初步构建了MabinlinⅡ和Brazzein的乳酸乳球菌表达系统，为进一步开发食品级的甜蛋白表达系统奠定基础。