覆盆子中降血糖成分提取分离和主要活性成分鉴定

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覆盆子为蔷薇科悬钩子属落叶灌木华东覆盆子(rubus chingii Hu)的干燥未成熟果实,作为中国传统的药食同源植物,古籍记载其具有益肾、固精、明目等功效,现代研究也发现覆盆子具有抗癌、抗炎症等丰富的生物活性。糖尿病为长期危害人类健康的一种慢性疾病,α-葡萄糖苷酶抑制剂是通过降低餐后和空腹血糖水平预防和治疗糖尿病的一种普遍、有效方法,发现高效,低毒的天然来源α-葡萄糖苷酶抑制剂,对糖尿病的治疗及预防具有重要意义。本论文首先使用不同方法和溶剂提取覆盆子中的活性成分,然后采用自由基清除、α-葡萄糖苷酶、酪氨酸酶、黄嘌呤氧化酶和乙酰胆碱酯酶抑制能力评价覆盆子抗糖尿病、色素沉积、痛风和老年痴呆方面的应用潜力,筛选最佳活性模型;接着使用大孔吸附树脂柱对覆盆子中的降血糖活性成分进行分离和富集,并评价其体内体外降血糖活性,建立主要化学成分指纹图谱;最后采用Sephadex LH 20、C18柱等色谱分离手段和高分辨率质谱等检测手段鉴定降血糖活性组分中的主要化学组成。本论文主要结论归纳如下:(1)覆盆子中20%和40%乙醇的超声提取物的得率最高(P>0.05),为22.6%23.00%,40%乙醇超声和80%甲醇浸提物的总酚含量最高,分别为146.57和144.88 mg GAE/g(P>0.05);100%乙醇的超声和浸提物总黄酮含量最高,分别为26.95和25.72 mg QuE/g提取物(P>0.05)。60%甲醇超声提取物具有最强的DPPH自由基清除能力,IC50值为11.14μg/mL,40%乙醇超声提取物具有最强的α-葡萄糖苷酶抑制能力,IC50值为0.08μg/mL,远高于阳性对照药阿卡波糖(IC50值为70.20μg/mL)。80%乙醇浸提提取物、80%甲醇超声提取物和100%乙醇浸提提取物分别具有较好的黄嘌呤氧化酶、乙酰胆碱酯酶、酪氨酸酶活性抑制能力,IC50值分别为71.85μg/mL、44.22μg/mL和17.23μg/mL,但抑制能力与阳性对照有一定差距。因此,提取物的得率、总酚、总黄酮含量、抗氧化活性和酶抑制活性取决于提取方法和提取溶剂,超声波提取能有效提升覆盆子提取物的得率、总酚、总黄酮含量,抗氧化、抗α-葡萄糖苷酶、乙酰胆碱酯酶能力。40%乙醇提取物具有很好的抗糖尿病应用潜力。(2)使用超声辅助40%乙醇提取方法提取覆盆子中的α-葡萄糖苷酶抑制剂,并通过大孔吸附树脂对其进一步富集得到水相(156.19 g)、10%乙醇(17.87 g)、40%乙醇(67.97 g)、60%乙醇(39 g)、80%乙醇(4.05 g)和95%乙醇(1.3 g)6个洗脱组分。40%乙醇相(FPZ40)的α-葡萄糖苷酶活性抑制能力最强,其阿卡波糖活性当量值为1195 g阿卡波糖/g组分。采用高(FPZ-H)、低(FPZ-L)不同剂量的FPZ40灌胃C57BL/6小鼠,通过测定小鼠空腹和餐后血糖水平发现,FPZ-H组与FPZ-L组小鼠空腹血糖分别比阿卡波糖对照组低31.5%与30.9%,FPZ-H组餐后血糖最低,为724±25.01 mM,为阿卡波糖组的84%,控制组的71.2%,说明FPZ40能显著降低小鼠的餐后和空腹血糖水平。采用HPLC-QTOF-MS/MS技术,通过分析化合物的母离子、MS/MS裂解规律和分子式等信息,从FPZ40中鉴定或初步鉴定出了26种化合物,包括15种鞣花单宁(4个pedunculagin/casuariin及其同分异构体、4种galloyl-HHDP-glucose、4种鞣花酸衍生物、鞣花酸、casuarinin和casuarictin)、7种酚酸(丹酚酸C、caffeoylthreonic acid、brevifolin carboxylic acid、rubusin A、coumaroylthreonic acid、darendoside B、没食子酸乙酯)和4种黄酮类化合(原花青素2聚体、表儿茶素/儿茶素、香橙素-O-己糖苷和芹菜素-O-鼠李糖苷物)。(3)采用Sephadex LH-20、ODS中压柱、半制备型液相等色谱分离手段对FPZ40中的化合物进行分离纯化,共得到14个单体化合物;通过高分辨率质谱、核磁等对化合物的结构进行精确表征,得到5个化合物的精确结构,分别为对羟基苯甲酸(1)、gemin D(2)、短叶苏木酚酸(3)、没食子酸乙酯(13)和鞣花酸(14),其中gemin D为首次从覆盆子中鉴定的化合物。8个鞣花单宁类化合物的精确结构目前无法确定,通过化合物的MS/MS数据可以判断其结构为Galloyl-HHDP-glucose、Galloyl-Ellagic acid-HHDP-glucose、Roshenin C或其异构体、Rhoipteleanin E、Pedunculagin/Casuariin和ellagitannins。通过对覆盆子中分离的单体化合物进行α-葡萄糖苷酶活性抑制能力的评价发现,鞣花单宁类化合物具有很强的活性。以上研究结果可以为覆盆子在抗糖尿病功能性食品和保健品方面的应用和抗糖尿病活性的深入研究提供重要的技术参考和理论基础,具有重要意义。
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