论文部分内容阅读
目的：
原发性肝癌具有发病率高，易侵袭转移和复发等特点。目前关于肝癌治疗的有效方法仍然有限，因此肝癌是威胁人类健康的主要恶性肿瘤之一。中医在治疗晚期肝癌有其特色和优势，健脾化瘀方是我院治疗肝癌的重要验方。前期研究表明“健脾化瘀方”中药的抗癌机制可能与抑制细胞增殖和肿瘤新生血管生成、诱导细胞凋亡以及调控Smad3/Smad7平衡从而抑制上皮间质转化等方面。但尚未见从外泌体调控上皮间质转化的角度，去探讨“健脾化瘀方”抑制肝癌转移的机制。EMT(Epithelial mesenchymal transition)是指在特定生理或者病理条件下，上皮细胞失去上皮特性向间质细胞转化的过程。EMT是肿瘤细胞发生迁移侵袭的重要过程。外泌体(exosomes)是一类细胞外脂质囊泡,直径为40-110nm，内含RNA、蛋白质、miRNA、DNA片段等多种成分，是胞间信息传载体。因此本研究目的在于从外泌体分泌的角度来探讨健脾化瘀方对肝癌细胞迁移侵袭及上皮间质转化的影响，有助于为中医药治疗肝癌提供新的理论依据和治疗靶点,具有创新性和重要科学意义。
方法：
我们以不同时间(24H/48H)或不同浓度(0.5mg/ml；1mg/ml；2mg/ml；4mg/ml；8mg/ml)的健脾化瘀方去干预肝癌细胞MHCC-97H，用MTT检测不同时间或浓度健脾化瘀方对MHCC-97H细胞的增殖的影响。计算IC50值(半抑制浓度)确定后续实验所需的药物浓度。用转化生长因子TGF-β1处理肝癌细胞MHCC-97H诱导肝癌细胞发生EMT。培养EMT组和对照组(未EMT)肝癌细胞，EMT组分3组分别予高浓度(4mg/ml)和低浓度(2mg/ml)的健脾化瘀方及空白对照培养。然后分别收集细胞培养液上清，分离外泌体进行鉴定。采用透射电镜(Transmission Electron Microscope,TEM)观察外泌体颗粒形态；纳米颗粒追踪分析(Nanoparticle Tracking Analysis,NTA)去检测分离出来的MHCC-97H细胞来源的外泌体大小及浓度分布。Western-blot检测外泌体标志蛋白CD63、CD81、HsP70、CD9的表达情况，证实分离的纳米颗粒是外泌体。用上述四组外泌体，分别加入培养基与肝癌细胞共培养，用PHK26标记外泌体核酸，DAPI染色，追踪显示外泌体是否进入细胞内。观察各组外泌体与肝癌细胞共培养对肝癌细胞MHCC-97H侵袭转移及EMT标志蛋白的影响。证明外泌体可促肝癌细胞EMT和侵袭转移而健脾化瘀方可以抑制外泌体对肝癌细胞的侵袭转移和EMT。
结果：
(1)健脾化瘀方对肝癌细胞MHCC-97H增殖具有抑制作用，且呈一定的时间和浓度依赖性。当药物浓度为0.5mg/ml时，无明显的抑制作用。当药物浓度在4mg/ml时，对细胞的增殖有明显的抑制作用。此外，其抑制作用与时间也存在一定的相关性，在浓度≤2mg/ml时，培养24H的细胞抑制率高于培养48H的细胞抑制率；而浓度≥4mg/ml时，培养24H的细胞抑制率低于培养48H的细胞抑制率。健脾化瘀方对肝癌细胞MHCC-97H作用24H后，根据回归线性方程检验得出IC50=4.89,干预48H后，IC50=3.44，我们选取4mg/ml、2mg/ml的健脾化瘀方药物浓度作为后续实验所需的药物浓度。
(2)EMT模型的建立：TGF-β1干预48H后，显微镜下观察细胞形态，经过TGF-β1诱导后肝癌细胞MHCC-97H的细胞形态松散，呈梭形样改变。Westernblot结果显示TGF-β1处理的EMT组MHCC-97H细胞的间质转化的标志蛋白N-cadherin、Vimentin表达明显升高(P＜0.01),而上皮表型标志蛋白E-cadherin表达显著下降(P＜0.01)。
(3)外泌体的生物学特征：我们采用了超速离心法提取外泌体，通过透射电镜来观察到所提取外泌体的形态呈囊泡状，分布不一，有单个分布，也有聚集成组，背景清晰，无明显污染物，直径约在30-140nm之间。采用NTA检测外泌体的粒径分布，结果表明四组外泌体粒径的峰值在70-160nm之间，提取外泌体的粒径分布结果与电镜结果一致。Western-blot检测外泌体标志蛋白CD63、CD81,HsP70，CD9，结果表明外泌体的标志蛋白在MHCC-97H细胞都存在表达，由此表明本实验获得的外泌体是可靠的。用PKH26染料标记外泌体，DAPI染色细胞核，将MHCC-97H细胞与外泌体一起温育24小时。结果表明，PKH26标记的外泌体可定位于MHCC-97H细胞中，这表明MHCC-97H细胞来源的外泌体可被MHCC-97H细胞吸收内化。
(4)健脾化瘀方可以抑制肝癌细胞MHCC-97H的迁移侵袭及EMT：细胞的迁移实验表明健脾化瘀方对肝癌细胞MHCC-97H的迁移具有抑制作用，浓度越高，抑制作用越明显。干预24H,48H，EMT组的迁移率比空白组增强(P＜0.05)，当加入不同浓度的健脾化瘀方干预后，细胞的迁移率与EMT组相比明显降低(P＜0.05)，且EMT+4mg/ml药物组对MHCC-97H细胞迁移的抑制较EMT+2mg/ml药物组增强(P＜0.05)。细胞的侵袭实验表明健脾化瘀方能抑制肝癌细胞MHCC-97H细胞的侵袭，浓度越高，抑制作用越明显。干预48H后，EMT组的侵袭数与空白组相比明显增加(P＜0.05)，当加入不同浓度的健脾化瘀方干预后，侵袭数与EMT组相比明显降低(P＜0.05)，且EMT+4mg/ml药物组对MHCC-97H细胞侵袭的抑制较EMT+2mg/ml药物组增强(P＜0.05)。Westernblotting实验结果表明健脾化瘀方可以抑制MHCC-97H细胞的上皮间质转化，结果显示经TGF-β1诱导后的肝癌细胞MHCC-97H的上皮表型标志蛋白E-cadherin蛋白表达水平显著下调(P＜0.001)，Vimentin与N-cadherin蛋白分子表达显著上调(P＜0.001)；而加入不同浓度的健脾化瘀方处理后，与EMT组相比，E-cadherin蛋白表达水平显著上调(P＜0.001)，Vimentin与N-cadherin蛋白分子水平显著下调(P＜0.001)，且4mg/ml药物组与2mg/ml药物组相比E-cadherin蛋白表达水平上调更明显(P＜0.001)，Vimentin与N-cadherin蛋白分子水平下调更显著(P＜0.001)。
(5)健脾化瘀方可以通过外泌体抑制肝癌细胞MHCC-97H的迁移侵袭及EMT：细胞的划痕实验表明健脾化瘀方可以抑制外泌体对肝癌细胞MHCC-97H的迁移。采用超速离心法提取不同干预组的外泌体，将提取的外泌体与肝癌细胞MHCC-97H共培养24H和48H后，观察外泌体对细胞的迁移功能的影响，结果显示EMT-exo组的迁移率比空白组(P＜0.05)明显升高，而EMT+2mg/ml-exo药物组和EMT+4mg/ml-exo药物组的迁移率比EMT-exo组的明显降低(P＜0.05)，且EMT+4mg/ml-exo药物组对细胞迁移的抑制比EMT+2mg/ml-exo药物组更为明显(P＜0.05)。细胞的侵袭实验表明健脾化瘀方能抑制外泌体对肝癌细胞MHCC-97H的侵袭。不同干预组的外泌体与细胞共培养48H后，EMT-exo组的侵袭数比空白组明显升高(P＜0.05)，而EMT+2mg/ml-exo药物组和EMT+4mg/ml-exo药物组的侵袭数较EMT-exo组明显降低(P＜0.05)，且EMT+4mg/ml-exo药物组对细胞侵袭的抑制较EMT+2mg/ml-exo药物组更为明显(P＜0.05)。Westernblotting实验结果表明健脾化瘀方可以抑制外泌体对肝癌MHCC-97H细胞的上皮间质转化。结果显示EMT-exo组中E-cadherin蛋白表达水平显著下调P＜0.001)，Vimentin与N-cadherin蛋白表达水平显著上调(P＜0.001)；而EMT+2mg/ml-exo药物组、EMT+4mg/ml-exo药物组与EMT-exo组相比，E-cadherin(P＜0.001)蛋白表达水平上调显著，Vimentin与N-cadherin蛋白表达水平显著下调(P＜0.001)。且EMT+4mg/ml-exo药物组与EMT+2mg/ml-exo药物组相比E-cadherin蛋白表达水平上调更明显(P＜0.001)，Vimentin与N-cadherin蛋白分子水平下调更显著(P＜0.001)。
结论：
健脾化瘀方通过外泌体抑制肝癌细胞MHCC-97H细胞的迁移和侵袭，其机制可能与抑制上皮间质转化有关。
原发性肝癌具有发病率高，易侵袭转移和复发等特点。目前关于肝癌治疗的有效方法仍然有限，因此肝癌是威胁人类健康的主要恶性肿瘤之一。中医在治疗晚期肝癌有其特色和优势，健脾化瘀方是我院治疗肝癌的重要验方。前期研究表明“健脾化瘀方”中药的抗癌机制可能与抑制细胞增殖和肿瘤新生血管生成、诱导细胞凋亡以及调控Smad3/Smad7平衡从而抑制上皮间质转化等方面。但尚未见从外泌体调控上皮间质转化的角度，去探讨“健脾化瘀方”抑制肝癌转移的机制。EMT(Epithelial mesenchymal transition)是指在特定生理或者病理条件下，上皮细胞失去上皮特性向间质细胞转化的过程。EMT是肿瘤细胞发生迁移侵袭的重要过程。外泌体(exosomes)是一类细胞外脂质囊泡,直径为40-110nm，内含RNA、蛋白质、miRNA、DNA片段等多种成分，是胞间信息传载体。因此本研究目的在于从外泌体分泌的角度来探讨健脾化瘀方对肝癌细胞迁移侵袭及上皮间质转化的影响，有助于为中医药治疗肝癌提供新的理论依据和治疗靶点,具有创新性和重要科学意义。
方法：
我们以不同时间(24H/48H)或不同浓度(0.5mg/ml；1mg/ml；2mg/ml；4mg/ml；8mg/ml)的健脾化瘀方去干预肝癌细胞MHCC-97H，用MTT检测不同时间或浓度健脾化瘀方对MHCC-97H细胞的增殖的影响。计算IC50值(半抑制浓度)确定后续实验所需的药物浓度。用转化生长因子TGF-β1处理肝癌细胞MHCC-97H诱导肝癌细胞发生EMT。培养EMT组和对照组(未EMT)肝癌细胞，EMT组分3组分别予高浓度(4mg/ml)和低浓度(2mg/ml)的健脾化瘀方及空白对照培养。然后分别收集细胞培养液上清，分离外泌体进行鉴定。采用透射电镜(Transmission Electron Microscope,TEM)观察外泌体颗粒形态；纳米颗粒追踪分析(Nanoparticle Tracking Analysis,NTA)去检测分离出来的MHCC-97H细胞来源的外泌体大小及浓度分布。Western-blot检测外泌体标志蛋白CD63、CD81、HsP70、CD9的表达情况，证实分离的纳米颗粒是外泌体。用上述四组外泌体，分别加入培养基与肝癌细胞共培养，用PHK26标记外泌体核酸，DAPI染色，追踪显示外泌体是否进入细胞内。观察各组外泌体与肝癌细胞共培养对肝癌细胞MHCC-97H侵袭转移及EMT标志蛋白的影响。证明外泌体可促肝癌细胞EMT和侵袭转移而健脾化瘀方可以抑制外泌体对肝癌细胞的侵袭转移和EMT。
结果：
(1)健脾化瘀方对肝癌细胞MHCC-97H增殖具有抑制作用，且呈一定的时间和浓度依赖性。当药物浓度为0.5mg/ml时，无明显的抑制作用。当药物浓度在4mg/ml时，对细胞的增殖有明显的抑制作用。此外，其抑制作用与时间也存在一定的相关性，在浓度≤2mg/ml时，培养24H的细胞抑制率高于培养48H的细胞抑制率；而浓度≥4mg/ml时，培养24H的细胞抑制率低于培养48H的细胞抑制率。健脾化瘀方对肝癌细胞MHCC-97H作用24H后，根据回归线性方程检验得出IC50=4.89,干预48H后，IC50=3.44，我们选取4mg/ml、2mg/ml的健脾化瘀方药物浓度作为后续实验所需的药物浓度。
(2)EMT模型的建立：TGF-β1干预48H后，显微镜下观察细胞形态，经过TGF-β1诱导后肝癌细胞MHCC-97H的细胞形态松散，呈梭形样改变。Westernblot结果显示TGF-β1处理的EMT组MHCC-97H细胞的间质转化的标志蛋白N-cadherin、Vimentin表达明显升高(P＜0.01),而上皮表型标志蛋白E-cadherin表达显著下降(P＜0.01)。
(3)外泌体的生物学特征：我们采用了超速离心法提取外泌体，通过透射电镜来观察到所提取外泌体的形态呈囊泡状，分布不一，有单个分布，也有聚集成组，背景清晰，无明显污染物，直径约在30-140nm之间。采用NTA检测外泌体的粒径分布，结果表明四组外泌体粒径的峰值在70-160nm之间，提取外泌体的粒径分布结果与电镜结果一致。Western-blot检测外泌体标志蛋白CD63、CD81,HsP70，CD9，结果表明外泌体的标志蛋白在MHCC-97H细胞都存在表达，由此表明本实验获得的外泌体是可靠的。用PKH26染料标记外泌体，DAPI染色细胞核，将MHCC-97H细胞与外泌体一起温育24小时。结果表明，PKH26标记的外泌体可定位于MHCC-97H细胞中，这表明MHCC-97H细胞来源的外泌体可被MHCC-97H细胞吸收内化。
(4)健脾化瘀方可以抑制肝癌细胞MHCC-97H的迁移侵袭及EMT：细胞的迁移实验表明健脾化瘀方对肝癌细胞MHCC-97H的迁移具有抑制作用，浓度越高，抑制作用越明显。干预24H,48H，EMT组的迁移率比空白组增强(P＜0.05)，当加入不同浓度的健脾化瘀方干预后，细胞的迁移率与EMT组相比明显降低(P＜0.05)，且EMT+4mg/ml药物组对MHCC-97H细胞迁移的抑制较EMT+2mg/ml药物组增强(P＜0.05)。细胞的侵袭实验表明健脾化瘀方能抑制肝癌细胞MHCC-97H细胞的侵袭，浓度越高，抑制作用越明显。干预48H后，EMT组的侵袭数与空白组相比明显增加(P＜0.05)，当加入不同浓度的健脾化瘀方干预后，侵袭数与EMT组相比明显降低(P＜0.05)，且EMT+4mg/ml药物组对MHCC-97H细胞侵袭的抑制较EMT+2mg/ml药物组增强(P＜0.05)。Westernblotting实验结果表明健脾化瘀方可以抑制MHCC-97H细胞的上皮间质转化，结果显示经TGF-β1诱导后的肝癌细胞MHCC-97H的上皮表型标志蛋白E-cadherin蛋白表达水平显著下调(P＜0.001)，Vimentin与N-cadherin蛋白分子表达显著上调(P＜0.001)；而加入不同浓度的健脾化瘀方处理后，与EMT组相比，E-cadherin蛋白表达水平显著上调(P＜0.001)，Vimentin与N-cadherin蛋白分子水平显著下调(P＜0.001)，且4mg/ml药物组与2mg/ml药物组相比E-cadherin蛋白表达水平上调更明显(P＜0.001)，Vimentin与N-cadherin蛋白分子水平下调更显著(P＜0.001)。
(5)健脾化瘀方可以通过外泌体抑制肝癌细胞MHCC-97H的迁移侵袭及EMT：细胞的划痕实验表明健脾化瘀方可以抑制外泌体对肝癌细胞MHCC-97H的迁移。采用超速离心法提取不同干预组的外泌体，将提取的外泌体与肝癌细胞MHCC-97H共培养24H和48H后，观察外泌体对细胞的迁移功能的影响，结果显示EMT-exo组的迁移率比空白组(P＜0.05)明显升高，而EMT+2mg/ml-exo药物组和EMT+4mg/ml-exo药物组的迁移率比EMT-exo组的明显降低(P＜0.05)，且EMT+4mg/ml-exo药物组对细胞迁移的抑制比EMT+2mg/ml-exo药物组更为明显(P＜0.05)。细胞的侵袭实验表明健脾化瘀方能抑制外泌体对肝癌细胞MHCC-97H的侵袭。不同干预组的外泌体与细胞共培养48H后，EMT-exo组的侵袭数比空白组明显升高(P＜0.05)，而EMT+2mg/ml-exo药物组和EMT+4mg/ml-exo药物组的侵袭数较EMT-exo组明显降低(P＜0.05)，且EMT+4mg/ml-exo药物组对细胞侵袭的抑制较EMT+2mg/ml-exo药物组更为明显(P＜0.05)。Westernblotting实验结果表明健脾化瘀方可以抑制外泌体对肝癌MHCC-97H细胞的上皮间质转化。结果显示EMT-exo组中E-cadherin蛋白表达水平显著下调P＜0.001)，Vimentin与N-cadherin蛋白表达水平显著上调(P＜0.001)；而EMT+2mg/ml-exo药物组、EMT+4mg/ml-exo药物组与EMT-exo组相比，E-cadherin(P＜0.001)蛋白表达水平上调显著，Vimentin与N-cadherin蛋白表达水平显著下调(P＜0.001)。且EMT+4mg/ml-exo药物组与EMT+2mg/ml-exo药物组相比E-cadherin蛋白表达水平上调更明显(P＜0.001)，Vimentin与N-cadherin蛋白分子水平下调更显著(P＜0.001)。
结论：
健脾化瘀方通过外泌体抑制肝癌细胞MHCC-97H细胞的迁移和侵袭，其机制可能与抑制上皮间质转化有关。