花生是世界上重要的油用兼食用经济作物,由黄曲霉菌引起的花生黄曲霉毒素的污染,严重影响了花生的生产、贸易和食品安全,解决花生黄曲霉污染已成为刻不容缓的重要科学问题。目前对黄曲霉病还没有行之有效的化学防治手段,培育抗病品种是解决花生黄曲霉污染最有效的手段。而国内外对花生抗黄曲霉的分子机理研究甚少,对控制黄曲霉的抗性基因数目、作用机制、花生-黄曲霉菌互作的机理还不清楚,使培育抗黄曲霉品种进展缓慢。因此本研究通过筛选抗性种质资源,分离和鉴定花生抗黄曲霉候选基因,为研究其抗黄曲霉的分子机制,促进花生抗黄曲霉分子育种改良奠定基础。1.本研究以新会小粒为和粤油92为亲本,用“一株传”构建了 F9代300个RIL群体。2013年夏季于福清根据传统育种程序记录方法对RILs群体六个农艺性状进行了观察统计分析。结果显示六个农艺性状在RILs群体间差异比较显著,而根据频率分布表显示,这些性状变异范围广泛且呈连续分布,在亲本间存在超亲分离现象,表明这些观察性状大多为多基因控制的数量性状遗传。对RIL群体种子进行人工接种黄曲霉,计算感染指数,结果表明RIL群体对黄曲霉的侵染抗性表现差异显著,而且存在超亲优势,因此利用亲本遗传背景的差异和基因互补来改良花生抗黄曲霉抗性有潜力。群体指标相关性分析表明,群体中黄曲霉侵染抗性与青枯病抗性,单株果重之间相关性不显著,控制这些性状的基因之间可能不存在紧密连锁,通过分析初步筛选出了单株果重较高、兼抗黄曲霉侵染和青枯病的优质材料,为花生抗黄曲霉育种研究提供优良品种和种质资源。2.为了解花生抗黄曲霉的分子机制,通过基因芯片分析,获得了一个受黄曲霉诱导差异表达下调的NBS-LRR类抗病基因AhRAF27,利用RACE技术克隆其全长,采用生物信息学方法,对该基因编码蛋白从氨基酸组成、理化性质、跨膜结构域、二级三级结构及功能域等方面进行了预测和分析。AhRAF27基因全长3287bp,包含2820bp的ORF,编码939个氨基酸。该基因所编码蛋白的结构域含有NB-ARC、LRR功能域,与大豆、苜蓿、蓖麻等作物上的NBS-LRR类抗性蛋白具有高度相似性。qRT-PCR分析表明AhRAF27在种皮易受黄曲霉侵染的部位中表达量相对较大;在黄曲霉胁迫下,AhRAF27基因在抗、感黄曲霉品种上的表达差异明显,该基因在抗病品种中都上调表达,而在感病品种下调表达,说明这些基因可能参与了对黄曲霉的识别和防御反应;在激素SA,ABA,ET,PAC,MeJA处理下AhRAF27表现为下调表达,但差异不明显。3.芯片分析筛选出的另一个在干旱胁迫下受黄曲霉诱导下调的NB-ARC基因AhRAF32,通过RACE技术获得了该基因的全长cDNA序列,共有4217bp,包含3587bp的ORF,编码1198个氨基酸。结构域分析具有一段CC(卷曲螺旋)基序、一个NB-ARC区和2个LRR保守结构域,与苜蓿Rps1-k-2抗病蛋白具有高度相似性。分析表明AhRAF32在不同胁迫下(收获前干旱,干旱+接种黄曲霉处理,正常生长,正常+黄曲霉处理),在感病花生品种粤油92持续上调表达,而在抗病品种新会小粒中变化不大,激素(SA、ABA、ET、JA、PAC)干旱和低温激素处理后表达变化不明显。这些结果表明AhRAF32可能参与了相应抗黄曲霉胁迫的防御反应。4.根据基因芯片分析还筛出了一个受黄曲霉诱导下调表达的NBS-LRR类抗病基因AhRAF41,该基因全长cDNA为3435bp,编码981个氨基酸。该基因包含NB-ARC、2个富含亮氨酸基序(LRR)和一个TIR结构域,属于典型的TIR-NBS-LRR类的抗病基因家族。AhRAF41和大豆、苜蓿等物种的TIR-NBS-LRR类抗病蛋白聚类在一起,具有高度的同源性。荧光定量分析显示AhRAF41基因在果皮中的表达量最大,其次是在根组织中,而在胚组织中的表达量相对较低。在外源激素和干旱胁迫下AhRAF41基因的表达没有明显差异,在低温处理下上调表达。比较AhRAF41基因在抗、感花生果皮中的表达显示,干旱胁迫下抗性品种中AhRRA41基因受黄曲霉侵染上调表达,感病品种中表现为下调表达,说明AhRAF41基因参与了对黄曲霉的识别和应答反应,干旱胁迫可能促进了这一反应。