天冬酰胺内切酶(AEPs)是一类可催化短肽形成环化肽的关键酶,在植物体内分布广泛。其催化形成的大环寡肽含有一个环状主链和一个典型的半胱氨酸结(六个保守的半胱氨酸残基形成三个二硫键),该结构异常稳定,使得大环寡肽具有作为药物设计框架的巨大应用潜力,引起了研究者们广泛关注。而且,利用AEP环化酶将人工设计的活性肽进行环化,能提高其稳定性,延长其活性有效期,因此具有重要的应用意义。然而,从植物组织提取天然AEP环化酶操作难度大,酶的得率低,很大程度上限制了该酶的应用。利用高效的微生物表达系统获取重组AEP环化酶是直接而有效解决上述局限性的方法。因此,本研究通过克隆白花蛇舌草(Oldenlandia affinis)中AEP(Oa AEP1_b)环化酶编码基因,分别在大肠杆菌和毕赤酵母中进行表达。我们比较了不同的融合标签,包括麦芽糖结合蛋白(MBP),N-utilization substance A(Nus A),小泛素修饰蛋白(SUMO),绿色荧光蛋白(GFP)以及泛素(Ubiquitin)对AEP环化酶在大肠杆菌中表达量的影响,其中MBP显著提高了AEP的表达量,达到0.36±0.05mg/m L。另外,我们对AEP编码基因进行密码子优化,尝试将多个拷贝的AEP表达单元整合到毕赤酵母基因组进行表达并分泌到胞外。当基因拷贝数达到3时,AEP环化酶的表达量达到0.89±0.03 mg/m L,均远远高于在大肠杆菌中的表达量,继续增加基因拷贝数对AEP环化酶的表达量无明显提高。体外酶切实验等生化分析证实外源表达的AEP环化酶可对我们设计的含有靶序列的不同底物进行有效切割和环化。该研究为利用AEP环化酶进行肽工程研究与应用奠定了良好的实验基础,提供了一套高效的研究工具。