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本研究旨在明确猪去分化脂肪细胞(dedifferentiatedadipocytes,DFATs)成脂再分化与成肌转分化早期脂肪分化因子24(factor24foradipocytedifferentiation,Fad24)的表达模式,为证实Fad24为猪DFATs成脂再分化与成肌转分化启动的共性开关蛋白的研究奠定基础。研究采用“天花板培养”分离培养猪DFATs,用成脂诱导方法诱导猪DFATs成脂再分化,油红O染色和显微镜观察鉴定;用三种成肌诱导方法诱导猪DFATs的成肌转分化,显微镜观察进行形态学鉴定,间接免疫荧光法检测成肌细胞特异蛋白肌间线蛋白(Desmin)和肌球蛋白重链(myosinheavychain,MyHC)的表达,用实时荧光定量PCR技术检测成肌特异基因肌红蛋白(myoglobin,MyoG)mRNA的表达等;用实时荧光定量PCR技术分别检测猪DFATs成脂再分化和成肌转分化早期Fad24的表达模式。实验结果如下: 1.猪DFATs成脂再分化诱导 将猪DFATs诱导成脂再分化,诱导3d时长梭状的DFATs开始变短,胞质中出现了少量且较小的亮泡状结构,经油红O染色鉴定证实为脂滴。随着诱导时间的增加,细胞质中的脂滴逐渐增多和增大。 2.猪DFATs成肌转分化诱导 本研究采用三种在不同动物和不同细胞中诱导成肌转分化的方法,比较诱导猪DFATs成肌转分化的效果,旨在筛选诱导猪DFATs成肌转分化的较优方法。三种诱导成肌分化的方法包括,糖皮质激素(glucocorticoid,Glc)法、半乳糖凝集素-1(Galectin-1)法、5-氮杂胞苷(5-Aza-2-deoxycytidine,5-aza)法。用三种方法分别诱导猪DFATs成肌转分化6d、15d和21d,分别用倒置显微镜观察分化的细胞形态;诱导21d后用间接免疫荧光法检测Desmin和MyHC的表达,用Real-timeRT-PCR检测MyoGmRNA的表达。诱导后的细胞形态学观察显示,Galectin-1法诱导的肌管形态最佳,多核细胞数量也最多;5-aza法次之,但诱导过程中细胞死亡率较高;Glc法诱导的细胞形态不规则,多形成放射状突起,而且出现较多成脂转分化细胞。间接免疫荧光分析显示,Galectin-1法和Glc法诱导的成肌细胞,Desmin和MyHC都呈强阳性表达,而在5-aza法诱导的细胞呈弱表达。Real-timeRT-PCR检测显示,Galectin-1法和Glc法诱导的成肌细胞MyoGmRNA表达量都很高,而5-aza法诱导的细胞MyoGmRNA表达量显著(p<0.05)低于Galectin-1法和Glc法。从诱导细胞的肌管形态、生存能力、特异蛋白和基因的表达量等综合判断,诱导猪DFATs成肌转分化,Galectin-1法优于Glc法和5-aza法。 3.猪DFATs成脂再分化与成肌转分化早期Fad24的表达模式 为检测猪去分化脂肪细胞成脂再分化和成肌转分化早期Fad24的表达模式,将F3代猪DFATs分为2组,一组进行成脂再分化诱导,另一组进行成肌转分化诱导。每组分别诱导0h、3h、6h、12h、24h并提取总RNA,反转录cDNA,然后用Real-timeRT-PCR检测Fad24的相对表达量。在成脂再分化组,Fad24的相对表达量3h时达到峰值,随后下调,到24h时再升高;在成肌转分化组,Fad24的相对表达量也在3h时达到峰值,随后到12h为止一直处于下调状态。 用上述三种方法诱导猪DFATs成肌转分化时,Galectin-1法诱导效果最佳;在诱导猪DFATs成脂再分化和成肌转分化早期,Fad24的表达量在诱导3h时都出现峰值,这表明Fad24在猪DFATs成脂再分化和成肌转分化启动过程中都发挥重要作用。