抗体在现代医学中起着重要的作用，被广泛地运用于实验室研究、疾病的诊断与治疗。噬菌体抗体库技术为人单抗的制备开创了一个全新的技术领域，它使用聚合酶链延伸反应(PCR)方法，把免疫球蛋白全套可变区基因扩增出来，重组到原核表达载体中，并通过与噬菌体外壳蛋白形成融合蛋白，使抗体片段表达于噬菌体表面，这样可用类似亲和层析的方法，筛选特异性的可变区基因。这样就可以不经过杂交瘤、甚至不经过免疫就可获得特异地结合不同抗原的抗体片段。本实验用PCR，从正常人外周血中分离淋巴细胞，克隆出抗体重链和轻链的可变区基因，重组到表达载体中，构建了人源性噬菌体抗体库。 一、抗体轻、重链基因的扩增。这一部分主要包括以下步骤：①淋巴细胞的分离②总RNA的提取③mRNA的纯化④反转录⑤PCR。结果：共提取出RNA 640μg；mRNA的纯化后得到7.2μg。经过RT-PCR，VH，VL及VK的每一条5’端引物与其相应的3’端引物都成功地扩增出可变区基因片段。 第 四 军 医 大 学 硕 士 学 位 论 文 二、载体酶切、连接、转化条件的优士。较高的酶切效率、连接 及转化效率，对于保证抗体库的纯度和容量的大小是十分重要 的。在这一部分中，主要就这一方面快一探讨。对pDANS分别 用 Xho、Nhe、BssH 11并在不同缓冲条件下进行酶切，其酶 切效率通过电转化的方法进行测定；人pDpNS载体上切下一小 片段，在连接回去，观察载体与片段的连接效率；纯质粒及连接 体系中质粒转化效率的测定。结果：XllOI、Nllll、BSSH IJ的 酶切效率是非常高的，可以满足均建抗体库的要求。而 Sal的 酶切效率却只有 50％左右。XI。O无论是在其最适缓冲液（H h肚r）还是在由低盐缓冲液山，1加殃r）所矫正（每川…体系加 入 IPllM的 NaCI）的体系当中都能够取得较高的酶切效率；载 体与片段的连接效率为 2刁8 x 10s’pg载体，说明如果能够保证 这些片段的两端完全被限制性内切酶听消化，那么要构建一个库 容量为 10’的抗体库，仅需十多次连接和一百多次转化即可；纯 质粒的转化效率一般可达到：IXIO＼5 XIO’转化于；’pgDNA。连 接体系中质粒的转化效率较纯质粒低，而T4DNA连接酶是影响 其转化效率的主要因素。通过热灭话将 T4 DNA连接酶灭活，或 者用酚、氯仿抽提后，体系中的＊＼人转化问题基本可以得到解 决，能够达到与单纯质粒相近的转化效率。 三、PCR产物酶切及连接效率的改进二PCR产物的克隆对于抗体 库的构建是十分重要的一步。但是，由于PCR产物的酶切效率很 低，致使片段两端不能够被完全切开，最终使得PCR产物的克隆 效率较低。这一部分就此问题进行了探讨。发现：①两端完全切 开的片段与载体连接，每… l连接产物可以得到约 l叫．4 XIO’个 克隆，完全可以满足抗体库的要求。所以，关键问题就是如何能 第 四 军 医 大 学 硕 士 学 位 论 文 够得到两端被完全消化的可变区基因片段：②P＊R产物直接酶切 效率很低，即使在酶切位点之外填加了长达36hp的保护序列，并 且把消化时间延长至12小时，结果也只有50％左右的片段被完 全消化切开。因此，增加保护序列的长度或者延长酶切的时间并 不能够解决＊＊R产物难以酶切的难题：③同样，P＊R产物经过酶 切后直接与载体连接的效率很低；④而PCR产物与T载体连接 的效率较高，可满足抗体库的要求厂⑤将pSP73改造后制备成 丁载体。 四、人源性天然抗体库的构建。首先用前面阐述的T载体方法， 先将轻链、重链可变区基因片段分别克隆入PSp73＊中，构建出 轻链库和重链库。然后，将轻链片段从PSp73＊上切出来，克隆 入pDANS中，再将重链片段从PSp73＊上切出来，并克隆入己 有轻链插入的pDANS中。这样，经过这两步分步克隆，就构建 出了人源性单链抗体库。下一步，再经过噬菌体挽救，就可以将 这一抗体库呈现在噬菌体的表面了。 经过以上四个部分，一个人源性单链抗体库就建成了。今后， 应用相应的抗原物质，可以对其进行有目的的筛选，就可获得具 有一定亲和力的抗体c