研究背景：化学性肝损伤已成为继病毒性肝损伤之后的第二大肝病诱因,目前临床应用的500至1000余种中西药物以及多种化学药品,均可引起不同程度的肝病。据国内外资料报道,有20%的暴发性肝衰竭由化学药物引起。近年来,化学性肝损伤呈增加趋势,严重威胁人们的生命健康。研究肝炎的发生机理及寻找有效的治疗措施是国内外学者共同研究的热门课题,大量研究表明,国内很多专家学者把研究的重点转向我们传统的中药,研究治疗肝炎的中药是目前我国研究领域的一个热点。但目前临床上仍缺乏有效的防治药物,因而加强肝脏损伤保护研究、开展对化学性肝病的防护工作,对于提高人类健康水平具有重要意义。西医用于肝炎的治疗多见于抗病毒药、护肝降酶药及免疫调节类药物,目前临床上常用的品种有干扰素、阿糖胞苷、干扰素诱导剂聚肌胞、无环鸟苷、左旋咪唑、转移因子、辅酶Q、胸腺素、右旋儿茶素、甘草甜素、齐墩果酸、葫芦素B、葫芦素E、联苯双酯、维生素类等。临床治疗结果表明,这些药物多具有良好的抑制病毒复制,恢复正常肝功能,保护肝细胞等作用,并且疗效迅速,不足之处为远期疗效不稳定,易反复,HBsAg转阴率低,有些药品价格昂贵和表现一定的副作用。中医学认为肝损伤的病因多与外感时邪、饮食失常、情志失调或正气虚弱等有关。金实等认为本病的病因主要是外感湿热邪毒和饮食不当,并且与体虚劳倦有关,病机变化主要为湿热邪毒蕴结肝脾,肝胆失疏,脾胃不健,气滞血瘀,脉络失和所致。连粤湘等认为本病的病因病机为湿热外侵或疫毒感染,郁于脾胃,以致湿热熏蒸,脾失健运,肝失疏泄,肝脾不和,胆液外溢而为之。孙江桥等认为本病的病因病机多为湿热毒淤,肝郁气滞,瘀血阻络,脾失健运,肝肾阴虚所致。中医中药具有不良反应较少,可长期服药的特点。近年来,中药治疗肝炎取得了良好的疗效。生物碱(alkaloid)是存在于生物体(主要为植物)中的一类含氮的有机化合物,大多数有复杂的环状结构,氮原子多包含在环内,多呈碱性,可与酸成盐,有显著的生物活性,是中草药中重要的有效成分之一。生物碱是研究得最早的一类有生物活性的天然有机化合物。目前已分离到10000余种,其中80余种已用于临床,如黄连中的小檗碱用于抗菌消炎,麻黄中的麻黄碱用于平喘,萝芙木中的利血平用于降压,喜树中的喜树碱与长春花中的长春新碱用于抗肿瘤等。目前已对数十种生物碱进行了研究,麻黄碱、苦参碱、氧化苦参碱、秋水仙碱、烟碱、毒藜碱、罂粟碱、吐根酚碱、半边莲碱、奎宁、辛可宁、紫堇碱、小檗碱、吗啡、可待因、汉防己碱、延胡索乙素、吴茱萸碱、乌头碱、马钱子碱、士的宁、长春碱、长春新碱、厚朴碱、槟榔碱、槟榔次碱、东莨菪碱、山莨菪碱、木兰碱、蝙蝠葛碱、青藤碱、青风藤碱、莲花氏碱、麦角新碱、利血平、红豆杉醇、贝母碱等。其中许多以应用于临床并取得较好的疗效,如麻黄碱、秋水仙碱、苦参碱、吗啡、麦角新碱、延胡索乙素山莨菪碱等。文献已有报道不少生物碱对肝脏具有保护作用,例如：粗叶悬钩子总生物碱对急性肝损伤大鼠肝组织CYP2E1与CYP3A1酶mRNA表达的影响,岩黄连总碱提取物对小鼠免疫性肝损伤的改善作用,鬼针草提取物对小鼠实验性肝损伤的预防作用,氧化苦参素碱的抗乙型和丙型肝炎病毒效应,延胡索乙素对四氯化碳致小鼠肝损伤的保护作用。红背叶根为双子叶植物药大戟科植物红背山麻杆Alchornea trewioides (Benth.) Muell.-Arg.的根,别名为名红灵丹、红罗裙、红帽顶、红背娘、红骨白颧树根。主要分布于我国中部和东南、华南。其味甘,性凉,根四季可采,载于《广西中草药》。灌木或小乔本,嫩枝有毛,生山坡、荒地的灌丛中。具有清热解毒,祛风除湿,散瘀止血,平喘,杀虫止痒等作用。传统应用于治疗肠炎腹泻。痢疾,黄疸型肝炎,尿路感染和结石,肾炎,小便不利,尿血,血崩,白带,湿疹,荨麻疹,疮痈肿毒,疮疡久不收口等症。同时也用于治疗各型肝炎,是民间常用的保肝治肝药物,但目前国内外对其研究尚未深入报道。现代医学研究表明,红背叶根中含生物碱和酚性物质,具有止咳、祛痰作用,抗乙酰胆碱作用和轻度抑制金黄色与白色葡萄球菌作用。本课题组首次发现其水提物及水提醇沉所得的浸膏具有抗肝炎病毒和阻止肝纤维化的作用,有保肝、降酶、抗肝纤维化作用。体外实验研究表明有一定的抗乙肝病毒的作用。抗鸭乙肝病毒试验表明红背叶根有抑制体内D-HBV复制的作用,作用与剂量和用药时间相关。其作用较拉米夫定弱,但维持时间长、服药安全。课题组研究了红背叶根对卡介苗和脂多糖诱导的小鼠免疫性肝损伤的保护作用,结果表明红背叶根可显著改善免疫性损伤小鼠胸腺、肝脏、脾脏系数,降低血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶、一氧化氮的活性以及肝组织匀浆中TNF-α、IL-1β的含量,提示红背叶根对免疫性肝损伤具有显著的保护作用。上述实验表明,红背叶根是一个较为理想的多途径、多靶点、多环节治疗乙肝的候选药物。但经文件检索发现目前对红背叶根的研究并不多。研究目的：本课题组通过不同的提取方法对红背叶根进行提取,并比较不同提取方法所得的生物碱的含量,从中找到提取红背叶根生物碱中的最佳提取方法,并从中分离得出生物碱。同时比较不同提取方法的提取物对肝损伤的保护作用,对红背叶根总生物碱对四氯化碳所致的急性肝损伤的作用进行初步研究,以了解红背叶根中的有效成分,进而为其进一步的研究开发奠定理论和实验基础。研究方法：1红背叶根不同成分的提取1.1粉碎：除去泥沙杂质后,将红背叶根粉碎成粗粉,备用。1.2水提：取红背叶根原药材加8倍量水,加热回流2小时,收集提取液。残渣再加8倍量水加热回流2小时,过滤,合并提取液,蒸去多余水份,浓缩,冷藏备用。1.3醇提：取红背叶根原药材加8倍量95%乙醇,加热回流2小时,收集提取液。残渣再加8倍乙醇加热回流2h,过滤,合并提取液,回收乙醇后,冷藏备用。1.4生物碱的提取：采用酸水-碱化-亲脂性溶剂萃取,最终得到总生物碱。按与原药材的比例配置成一定浓度混悬水液。生物碱中、低剂量组分别用混悬液加蒸馏水稀释成1/2、1/4剂量,冷藏备用。2红背叶根不同提取物对四氯化碳致急性肝损伤小鼠的实验研究2.1实验分组昆明种小鼠96只,体质量18～22 g,雌雄各半(南方医科大学实验动物中心提供)。采用随机分组的方法分为正常组、模型组、联苯双酯组(175mg/kg)、红背叶根水提物(7.8g生药/kg)、红背叶根醇提物(7.8g生药/kg)及红背叶根总生物碱高(7.8g生药/kg)、中(3.9g生药/kg)、低(1.95g生药/kg)剂量组,每组12只,雌雄各半。除正常组小鼠外,其余小鼠在造模的同时灌胃给药,灌胃剂量为0.5m/20g,正常组小鼠给同等剂量生理盐水。2.2造模方法连续灌胃给药5 d,第5天给药后1 h,采用腹腔注射0.12%四氯化碳(用橄榄油配制)0.1 ml/10 g,正常组小鼠腹腔注射相同体积的橄榄油,禁食不禁水16小时。2.3指标检测2.3.1摘眼球采血后,离心获得血清,按试剂盒说明操作检测血清ALT、AST、T.Bili活性。2.3.2肝脏组织病理学检查：处死动物,取出肝脏,用冷生理盐水洗去浮血,拭干。于肝门处及右肝叶取材1块,用10%中性福尔马林溶液固定,70%、80%、90%、95%、100%乙醇脱水,二甲苯透明,石蜡包埋,切片机作4um切片,常规脱蜡,HE染色,中性树胶封片。用显微镜观察,以及PM-20型显微摄像系统照相。2.4统计处理方法实验结果计量资料用均数±标准差,方差齐性时,组间比较用One-Way ANOVA。采用LSD方法进行组间多重比较；方差不齐时,用Welch法,采用DunnettT3方法进行组间多重比较。用统计软件SPSS13.0进行分析,数据以(X±s)表示,P<0.05定为差异有统计学意义。结果：1采用不同提取方法对红背叶根成分进行提取,并比较所得的生物碱的含量,最终得出的结果为：采用水提法和醇提法所提取得到的生物碱的量约为0.06%,采用醇提法,提取所得生物碱含量稍高些。采用水提法,提取出来的其他非生物碱成分较多,分离生物碱比较麻烦。所以提取生物碱的较佳途径为醇提法。2与正常组比较,模型组血清ALT、AST水平升高(P<0.05),表明本次实验的小鼠急性肝损伤造模成功。红背叶根水提物、醇提物及总生物碱高、中、低剂量组与模型组相比差异有统计学意义(P<0.05)。与正常对照组相比较,模型组小鼠血清中胆红素水平升高(P<0.05),各给药组与模型组比较,血清胆红素的活性差异有统计学意义(P<0.05)。3小鼠肝组织形态学观察,镜下观察各组小鼠肝脏的病理变化。模型组小鼠肝细胞改变明显,部分肝小叶失去正常结构,肝细胞有不同程度的坏死灶伴炎症细胞浸润,部分可见体积增大,呈空泡片状病变,与正常组相比有显著性差异,提示造模成功。阳性药联苯双酯组小鼠肝细胞基本正常,仅见部分轻度肿胀,未见坏死灶。红背叶根水提物组、醇提物组、总生物碱高剂量组肝细胞轻度肿胀,未见坏死灶。总生物碱中剂量组肝细胞轻度肿胀,有点状坏死。低剂量组肝细胞肿胀明显,伴有散在点状坏死。红背叶根三种提取物组与模型组相比较上述病理改变有所减轻。结论：1红背叶根总生物碱的较佳提取方法为：用8倍量的95%乙醇提取红背叶根中的总生物碱,本方法含杂质少,且含量较高。2结果显示红背叶根水提物、醇提物、总生物碱均具有预防四氯化碳所致肝损伤的作用。3红背叶根抗急性肝损伤的有效成分之一是红背叶根总生物碱,为红背叶根的进一步的研究开发奠定理论和实验基础。