随着畜牧业越来越向集约化生产快速发展,畜禽养殖中往往无法建立充分的免疫环境,从而影响免疫预防效果。而中药多糖是普遍存在于植物、动物及微生物的一大类天然生物大分子,具备多种生物活性功能。现代药理研究发现,中药多糖具有广泛的免疫调节与促进作用,且药效安全稳定,毒副作用小,是良好的生物反应调节剂。本研究采用一步醇沉和分步醇沉法提取桔梗总多糖和2个分级多糖,分离纯化后通过体外对鸡外周血淋巴细胞增殖,淋巴细胞周期分布及淋巴细胞亚群CD⁴⁺/CD⁸⁺比例的影响,比较了4个多糖的免疫增强活性。采用一步醇沉和分步醇沉法提取粗的桔梗总多糖（PGPStc）和2个分级桔梗多糖（PGPS60c和PGPS80c）,采用Sevag法除蛋白,Sephadex G-75凝胶过滤柱对PGPStc进行层析,得到纯化多糖PGPStp,分别用苯酚-硫酸法和考马斯亮兰法测定多糖和蛋白含量,红外光谱法鉴定多糖结构。结果显示,桔梗多糖的提取率以PGPS80c最高。PGPS60c、PGPS80c、PGPStc、PGPStp的多糖含量分别为53.7%、63.5%、64%和73%。各多糖的蛋白含量均较低。红外光谱分析结果表明,桔梗多糖具有糖的典型特征吸收峰。将PGPS60c、PGPS80c、PGPStc、PGPStp加入到鸡外周血淋巴细胞培养体系中,用MTT法测定其安全浓度。结果表明,PGPS60c和PPS80c在500μg mL-1,PGPStc在250μg mL-1,PPStp在62.5μg mL-1时的细胞A570值刚好不显著小于细胞对照组（P>0.05）,因此可将该浓度定为它们的最大安全浓度。为便于同水平比较,将各多糖的最大试验浓度统一设为62.5μg mL-1。为了比较上述4个多糖的体外免疫增强作用,取安全浓度范围内5个浓度的4个多糖,分别单独或与PHA一起加入到培养的鸡外周血淋巴细胞中,用MTT法测定淋巴细胞增殖的变化。结果显示,多糖单独加入到外周血淋巴细胞时,4个多糖几乎所有浓度显著刺激细胞增殖（P<0.05）,PGPStc在31.25μg mL-1时的细胞增殖率最高,为80.61%;多糖与PHA同时加入到外周血淋巴细胞时,PGPS60c在15.625³1.25μg mL-1、PGPStp在3.907¹5.625μg mL-1显著刺激细胞增殖,PGPStc在31 25μg mL-1时的细胞增殖率最高;结果表明,桔梗多糖可以促进淋巴细胞增殖,以PGPStc的作用最强,可能是桔梗多糖增强免疫活性的最佳部位,其次为PGPS60c。将筛选出的多糖PGPStc和PGPS60c在31.25μg mL-1时刺激淋巴细胞,分别在24h、48 h和72 h收集细胞,经过处理,用流式细胞仪检测各个时间点的周期分布情况。结果显示,在72h之内未经任何处理的细胞大部分处于G0/G1期,其变化不明显（P>0.05）。与PHA组对比,PGPS60c、PGPStc组均可以在24h、48h使G0/G1期细胞的百分比降低,而S期和G2/M期细胞的百分比明显升高（P<0.05）。PGPS60c和PGPStc作用于鸡外周血淋巴细胞48h时,其PI值、SPF值均最大。分别在24 h、48 h和72 h收集细胞,PBS洗涤2次,流式细胞仪检测CD⁴⁺、CD⁸⁺T淋巴细胞亚群的变化。结果显示,PGPStc处理细胞48 h后,CD⁴⁺和CD⁸⁺淋巴细胞百分率显著高于PHA对照组（P<0.05）,表明PGPStc可以明显提高CD⁴⁺、CD⁸⁺淋巴细胞百分率。