酶作为高效生物催化剂与人体众多生理、病理过程息息相关,也常作为生理标志物被用于疾病诊断。荧光探针因其无创多样、便捷直观的特性常被用于酶活性的在体检测中。然而目前大部分检测探针在酶激活后产生的荧光易于从检测目标中弥散,从而降低了活细胞或活体动物荧光成像中的信噪比。为了解决该问题,本论文基于高活性的亚甲基苯醌展开研究,发展了一系列通过与蛋白形成共价键而实现信号分子局部集中的荧光体系。论文整体分为四个部分:第一部分首先对酶的重要性及用于酶活性检测的荧光探针进行了简单介绍,阐述了一般酶检测探针普遍存在的荧光信号弥散问题。在此基础上,总结了包括QMs共价标记策略在内的主要解决方法。第二部分以碱性磷酸酶为模型酶,对“自锚定”试剂的蛋白标记效能与QMs前体结构间的关系进行详细评价与结构优化。论文中合成了一系列具有不同结构特点的QMs型荧光探针,并通过蛋白凝胶荧光扫描及活细胞成像实验对其效能进行了综合性研究,从中得到了蛋白标记效能最佳的“多锚点”QMs前体。并基于该骨架开发出环境敏感型“自锚定”近红外探针,实现了活体动物内源碱性磷酸酶的在体原位荧光成像。第三部分利用烯烃复分解反应,快速“组装”得到了一系列β-内酰胺酶QMs型荧光探针。通过凝胶内蛋白荧光成像对QMs的构效关系再次进行评估,进一步确认了“多锚点”QMs前体的蛋白标记高效性。第四部分将QMs与增强型近红外探针相结合,发展了β-半乳糖苷酶自锚定与增强型荧光探针。这一探针在目标酶作用下,可同时实现荧光信号的增强与荧光分子在蛋白质上的共价键锚定,从而提升有效荧光信号在细胞内的保留能力。这一探针在细胞荧光成像和流式细胞分析中,相较于常规增强型探针,均表现出更好的检测能力和成像效果。综上,本论文首先基于两种模型酶设计、合成了一系列“自锚定”荧光探针,并且系统地评价了 QMs蛋白标记效率的构效关系,得到了效能最优的“多锚点”QMs前体。这一高效的“多锚点”QMs骨架将有望进一步用于药物靶向递送、诊疗一体药物研发、分子影像学等领域。其次,通过烯烃复分解反应实现荧光探针的快速“组装”,这一策略可实现后期对含有不同酶识别位点的荧光探针的快速合成。此外,通过在近红外探针中引入离去基团得到了增强型“自锚定”近红外荧光探针,有效减少了探针被激活后的扩散,在荧光成像中取得了更好的效果。这一探针设计策略有望在其它酶活性检测探针中得到更为广泛的应用。