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研究背景
前列腺癌是全球男性发病率第二的恶性肿瘤，也是我国常见的男性生殖系统肿瘤。近年来，随着人们生活方式的改变，人口老龄化及血清前列腺特异性抗原(Prostate specific antigen，PSA)筛查的推广，前列腺癌的发病率快速增长。目前，雄激素剥夺疗法(Androgen deprivation therapy，ADT)是治疗局限性前列腺癌的标准疗法，但大多数患者会出现生化复发或发展为恶性程度更高的去势抵抗性前列腺癌(Castration-resistant prostate cancer, CRPC)，然而CRPC的标准治疗方案如阿比特龙(Abiraterone，Abi)和恩杂鲁胺(Enzalutamide，ENZ)疗效有限，并伴随胃和血液学副作用，最终产生耐药性。因此，迫切需要寻找治疗CRPC的新方法。
人抑制素(Prohibitin，PHB，也称PHB1，UniProtKB-P35232)在多种类型的肿瘤中异常高表达。PHB1是一种多功能蛋白，其具体功能与其亚细胞定位密切相关。已有研究报道，膜定位的PHB1在MAPK信号通路中发挥重要的调控作用，是K-Ras介导的C-Raf激活所必需;核定位的PHB1则可发挥转录共调节因子的作用，抑制AR及其下游靶基因的转录;定位于线粒体内膜的PHB1与PHB2相互作用形成环状复合物，维持线粒体结构，稳定线粒体蛋白，从而保持健康的线粒体网络。
靶向PHB1的小分子配体FL3是天然中药米仔兰提取物黄褐素(Flavaglines)的人工合成衍生物，已被证实具有抗癌活性而对正常组织无毒性。研究表明FL3与PHB1结合后，可通过影响PHB1蛋白的亚细胞分布，抑制MAPK信号通路的过度激活等发挥抗癌活性。目前尚未有FL3在前列腺癌组织和细胞中是否发挥抑癌作用及其机制的研究报道。
研究目的
1)探究PHB1是否参与了前列腺癌的去势抵抗
2)探究PHB1参与前列腺癌去势抵抗的分子机制
3)探究PHB1小分子配体FL3在前列腺癌中是否有治疗作用
4)探究FL3靶向PHB1抑制CRPC的分子机制
研究方法
一、PHB1表达量与前列腺癌进展的关系
1)数据库分析PHB1与前列腺癌恶性进展的关系
2)免疫组化检测PHB1在不同Gleason评分的前列腺癌组织中的表达情况
3)RT-qPCR和Westernblot检测前列腺癌细胞系PHB1的基础表达量
二、PHB1在前列腺癌恶性进展中的作用
1)使用PHB1表达质粒分别瞬时转染在FBS(Fetal bovine serum)正常培养和CSS(Charcoal-stripped fetal bovine serum)激素剥夺培养条件下的LNCaP细胞;PHB1siRNA分别瞬时转染在FBS和CSS培养条件下的C4-2B细胞;PHB1siRNA转染在FBS培养条件下的PC3细胞
2)进行细胞功能实验，包括MTS、Transwell侵袭转移实验，检测PHB1对前列腺癌细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响
三、PHB1参与前列腺癌去势抵抗的分子机制初探
1、PHB1和雄激素受体(Androgen receptor, AR)信号途径的关系
LNCaP/C4-2B细胞在激素剥夺条件下培养3d，耗竭雄激素后，加入DHT刺激，检测AR及PHB1表达的改变
2、激素剥夺条件下培养是否会改变PHB1的亚细胞分布
分别在CSS和FBS条件培养LNCaP和C4-2B细胞，采用核浆分离和免疫荧光实验检测激素剥夺对PHB1亚细胞定位的影响
四、PHB1小分子配体FL3与ENZ联用增强ENZ的治疗效果
使用不同浓度FL3处理LNCaP/C4-2B/PC3细胞，MTS检测细胞增殖能力
1)单用ENZ、FL3以及联合应用ENZ与FL3处理LNCaP/C4-2B细胞，MTS检测增殖能力
2)C4-2B细胞裸鼠荷瘤实验检测FL3在体内对前列腺癌的治疗效果
五、FL3抑制PHB1治疗CRPC的分子机制
1)LNCaP/C4-2B细胞经FL3处理后，采用核浆分离、免疫荧光实验，检测PHB1亚细胞定位的改变
2)LNCaP/C4-2B细胞经FL3处理后，Westernblot检测C-RAF/MEK/ERK磷酸化级联激活的改变
3)LNCaP/C4-2B细胞经FL3处理后，RT-qPCR检测AR及其下游靶基因转录水平的改变
四、研究结果
一、在去势抵抗性前列腺癌中，PHB1的表达显着上调
数据库挖掘、免疫组化结果显示PHB1在高Gleason评分的前列腺癌组织以及CRPC模型中表达上调，基础表达量检测显示，与正常前列腺上皮细胞相比，PHB1在前列腺癌细胞系中高表达，同时在CRPC细胞系中的表达显着高于雄激素依赖性前列腺癌(Androgen dependent prostate cancer，ADPC)细胞系。
二、PHB1促进前列腺癌细胞增殖、迁移、侵袭能力，参与去势抵抗
进行细胞功能学实验，MTS实验显示:在LNCaP中，过表达PHB1，细胞增殖能力与对照组相比显着提高，且由于CSS条件培养导致的LNCaP细胞生长抑制可以被PHB1的过表达所部分逆转，在C4-2B/PC3细胞中，转染si-PHB1的细胞增殖能力与对照组相比明显被抑制，同样，在CSS条件下培养的C4-2B细胞增殖能力受到抑制的程度高于在FBS条件下培养的细胞;Transwell实验显示:PHB1过表达促进LNCaP细胞侵袭、迁移能力，相反，敲除PHB1后显着抑制了C4-2B/PC3细胞的侵袭、迁移能力。以上结果证明:PHB1促进前列腺癌细胞的增殖、侵袭、迁移能力，降低前列腺癌细胞对雄激素的依赖性，参与去势抵抗
三、初探PHB1参与前列腺癌去势抵抗的分子机制
1、PHB1为雄激素抑制性基因
CSS条件下培养LNCaP/C4-2B细胞一段时间后，设置时间梯度和浓度梯度加入DHT刺激细胞生长，结果显示DHT刺激后，AR表达升高，PHB1的mRNA水平、蛋白水平表达均降低，并呈现时间和浓度依赖性。
2、激素剥夺影响PHB1的亚细胞分布
CSS条件下培养LNCaP/C4-2B细胞7d后，核浆分离和免疫荧光实验显示，与对照相比，PHB1由细胞核向细胞质易位。
四、PHB1小分子配体FL3与ENZ联用增强ENZ的治疗效果
MTS结果显示，FL3可以明显抑制前列腺癌细胞增殖，且在CRPC表型的C4-2B/PC3细胞中的抑制能力明显高于LNCaP细胞。联合应用FL3和ENZ可以增强ENZ的治疗效果。C4-2B异种移植物模型中进行体内实验，同样也证实了FL3对前列腺癌的治疗作用。
五、FL3抑制PHB1治疗CRPC的分子机制
1、FL3通过影响PHB1的亚细胞定位抑制前列腺癌细胞增殖
LNCaP细胞经FL340nM处理48h/C4-2B细胞经FL320nM处理48h后，采用核浆分离、免疫荧光实验，结果显示，与对照相比，PHB1由细胞质向细胞核易位。
2、FL3抑制MAPK信号通路激活
LNCaP/C4-2B细胞经FL3处理后，Westernblot实验结果显示RAS/C-RAF/MEK/ERK磷酸化级联减弱。
3、FL3抑制AR信号通路
LNCaP/C4-2B细胞经FL3处理后，RT-qPCR结果显示AR及其下游靶基因转录受抑制。
五、研究结论
PHB1在CRPC显着上调，并参与去势抵抗，促进前列腺癌的恶性进展，其配体药物FL3通过影响PHB1的亚细胞分布，抑制MAPK信号通路的过度激活，抑制AR及其下游靶基因的转录，从而抑制去势抵抗性前列腺癌细胞的增殖，同时FL3与ENZ联用，可以提高ENZ治疗效果，从而降低用药剂量，减少副作用。
前列腺癌是全球男性发病率第二的恶性肿瘤，也是我国常见的男性生殖系统肿瘤。近年来，随着人们生活方式的改变，人口老龄化及血清前列腺特异性抗原(Prostate specific antigen，PSA)筛查的推广，前列腺癌的发病率快速增长。目前，雄激素剥夺疗法(Androgen deprivation therapy，ADT)是治疗局限性前列腺癌的标准疗法，但大多数患者会出现生化复发或发展为恶性程度更高的去势抵抗性前列腺癌(Castration-resistant prostate cancer, CRPC)，然而CRPC的标准治疗方案如阿比特龙(Abiraterone，Abi)和恩杂鲁胺(Enzalutamide，ENZ)疗效有限，并伴随胃和血液学副作用，最终产生耐药性。因此，迫切需要寻找治疗CRPC的新方法。
人抑制素(Prohibitin，PHB，也称PHB1，UniProtKB-P35232)在多种类型的肿瘤中异常高表达。PHB1是一种多功能蛋白，其具体功能与其亚细胞定位密切相关。已有研究报道，膜定位的PHB1在MAPK信号通路中发挥重要的调控作用，是K-Ras介导的C-Raf激活所必需;核定位的PHB1则可发挥转录共调节因子的作用，抑制AR及其下游靶基因的转录;定位于线粒体内膜的PHB1与PHB2相互作用形成环状复合物，维持线粒体结构，稳定线粒体蛋白，从而保持健康的线粒体网络。
靶向PHB1的小分子配体FL3是天然中药米仔兰提取物黄褐素(Flavaglines)的人工合成衍生物，已被证实具有抗癌活性而对正常组织无毒性。研究表明FL3与PHB1结合后，可通过影响PHB1蛋白的亚细胞分布，抑制MAPK信号通路的过度激活等发挥抗癌活性。目前尚未有FL3在前列腺癌组织和细胞中是否发挥抑癌作用及其机制的研究报道。
研究目的
1)探究PHB1是否参与了前列腺癌的去势抵抗
2)探究PHB1参与前列腺癌去势抵抗的分子机制
3)探究PHB1小分子配体FL3在前列腺癌中是否有治疗作用
4)探究FL3靶向PHB1抑制CRPC的分子机制
研究方法
一、PHB1表达量与前列腺癌进展的关系
1)数据库分析PHB1与前列腺癌恶性进展的关系
2)免疫组化检测PHB1在不同Gleason评分的前列腺癌组织中的表达情况
3)RT-qPCR和Westernblot检测前列腺癌细胞系PHB1的基础表达量
二、PHB1在前列腺癌恶性进展中的作用
1)使用PHB1表达质粒分别瞬时转染在FBS(Fetal bovine serum)正常培养和CSS(Charcoal-stripped fetal bovine serum)激素剥夺培养条件下的LNCaP细胞;PHB1siRNA分别瞬时转染在FBS和CSS培养条件下的C4-2B细胞;PHB1siRNA转染在FBS培养条件下的PC3细胞
2)进行细胞功能实验，包括MTS、Transwell侵袭转移实验，检测PHB1对前列腺癌细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响
三、PHB1参与前列腺癌去势抵抗的分子机制初探
1、PHB1和雄激素受体(Androgen receptor, AR)信号途径的关系
LNCaP/C4-2B细胞在激素剥夺条件下培养3d，耗竭雄激素后，加入DHT刺激，检测AR及PHB1表达的改变
2、激素剥夺条件下培养是否会改变PHB1的亚细胞分布
分别在CSS和FBS条件培养LNCaP和C4-2B细胞，采用核浆分离和免疫荧光实验检测激素剥夺对PHB1亚细胞定位的影响
四、PHB1小分子配体FL3与ENZ联用增强ENZ的治疗效果
使用不同浓度FL3处理LNCaP/C4-2B/PC3细胞，MTS检测细胞增殖能力
1)单用ENZ、FL3以及联合应用ENZ与FL3处理LNCaP/C4-2B细胞，MTS检测增殖能力
2)C4-2B细胞裸鼠荷瘤实验检测FL3在体内对前列腺癌的治疗效果
五、FL3抑制PHB1治疗CRPC的分子机制
1)LNCaP/C4-2B细胞经FL3处理后，采用核浆分离、免疫荧光实验，检测PHB1亚细胞定位的改变
2)LNCaP/C4-2B细胞经FL3处理后，Westernblot检测C-RAF/MEK/ERK磷酸化级联激活的改变
3)LNCaP/C4-2B细胞经FL3处理后，RT-qPCR检测AR及其下游靶基因转录水平的改变
四、研究结果
一、在去势抵抗性前列腺癌中，PHB1的表达显着上调
数据库挖掘、免疫组化结果显示PHB1在高Gleason评分的前列腺癌组织以及CRPC模型中表达上调，基础表达量检测显示，与正常前列腺上皮细胞相比，PHB1在前列腺癌细胞系中高表达，同时在CRPC细胞系中的表达显着高于雄激素依赖性前列腺癌(Androgen dependent prostate cancer，ADPC)细胞系。
二、PHB1促进前列腺癌细胞增殖、迁移、侵袭能力，参与去势抵抗
进行细胞功能学实验，MTS实验显示:在LNCaP中，过表达PHB1，细胞增殖能力与对照组相比显着提高，且由于CSS条件培养导致的LNCaP细胞生长抑制可以被PHB1的过表达所部分逆转，在C4-2B/PC3细胞中，转染si-PHB1的细胞增殖能力与对照组相比明显被抑制，同样，在CSS条件下培养的C4-2B细胞增殖能力受到抑制的程度高于在FBS条件下培养的细胞;Transwell实验显示:PHB1过表达促进LNCaP细胞侵袭、迁移能力，相反，敲除PHB1后显着抑制了C4-2B/PC3细胞的侵袭、迁移能力。以上结果证明:PHB1促进前列腺癌细胞的增殖、侵袭、迁移能力，降低前列腺癌细胞对雄激素的依赖性，参与去势抵抗
三、初探PHB1参与前列腺癌去势抵抗的分子机制
1、PHB1为雄激素抑制性基因
CSS条件下培养LNCaP/C4-2B细胞一段时间后，设置时间梯度和浓度梯度加入DHT刺激细胞生长，结果显示DHT刺激后，AR表达升高，PHB1的mRNA水平、蛋白水平表达均降低，并呈现时间和浓度依赖性。
2、激素剥夺影响PHB1的亚细胞分布
CSS条件下培养LNCaP/C4-2B细胞7d后，核浆分离和免疫荧光实验显示，与对照相比，PHB1由细胞核向细胞质易位。
四、PHB1小分子配体FL3与ENZ联用增强ENZ的治疗效果
MTS结果显示，FL3可以明显抑制前列腺癌细胞增殖，且在CRPC表型的C4-2B/PC3细胞中的抑制能力明显高于LNCaP细胞。联合应用FL3和ENZ可以增强ENZ的治疗效果。C4-2B异种移植物模型中进行体内实验，同样也证实了FL3对前列腺癌的治疗作用。
五、FL3抑制PHB1治疗CRPC的分子机制
1、FL3通过影响PHB1的亚细胞定位抑制前列腺癌细胞增殖
LNCaP细胞经FL340nM处理48h/C4-2B细胞经FL320nM处理48h后，采用核浆分离、免疫荧光实验，结果显示，与对照相比，PHB1由细胞质向细胞核易位。
2、FL3抑制MAPK信号通路激活
LNCaP/C4-2B细胞经FL3处理后，Westernblot实验结果显示RAS/C-RAF/MEK/ERK磷酸化级联减弱。
3、FL3抑制AR信号通路
LNCaP/C4-2B细胞经FL3处理后，RT-qPCR结果显示AR及其下游靶基因转录受抑制。
五、研究结论
PHB1在CRPC显着上调，并参与去势抵抗，促进前列腺癌的恶性进展，其配体药物FL3通过影响PHB1的亚细胞分布，抑制MAPK信号通路的过度激活，抑制AR及其下游靶基因的转录，从而抑制去势抵抗性前列腺癌细胞的增殖，同时FL3与ENZ联用，可以提高ENZ治疗效果，从而降低用药剂量，减少副作用。