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研究背景
多发性骨骺发育不良(Multiple Epiphyseal Dysplasia，MED)(OMIM 132400)是一种骨软骨发育不良疾病，其遗传方式以常染色体显性遗传为主，部分患者为常染色体隐性遗传。现已发现8个致病基因，分别为COMP基因、COL9A2基因、COL9A3基因、DTDST基因、MATN3基因、COL9A1基因、CANT1基因和COL2A1基因。MED的主要临床表现为轻到中度身材矮小和膝、髋等关节的早发性骨关节炎，影像学检查主要表现为骨骺的骨化延迟和形状改变。
骨骺形成于骨干两侧，骺端与骨干之间残留的软骨组织为骺板，也称为生长板(Growth Plate，GP)。生长板内软骨细胞的增殖和分化是维持长骨纵向生长的动力。研究表明，MED的发生通常是由骨骺生长板中增殖区软骨细胞增殖能力下降或异常分化、肥大区软骨细胞凋亡异常或钙化延迟等原因导致成骨异常引起的。
在骨骺生长板中，除了软骨细胞外，还有大量软骨细胞外基质。软骨细胞外基质中的主要成分是胶原纤维和纤维基质。在胶原纤维和纤维基质间含有胶原蛋白(如Ⅸ型胶原蛋白)和非胶原性分子(如Matrilins和COMP)。已知MED致病基因的编码产物均为胶原蛋白或非胶原性分子。它们互相作用形成分子网络，介导胶原纤维和纤维外基质之间相互作用。这种分子网络的失衡在MED及其他骨软骨疾病的发生中起重要作用。
骨形态发生蛋白(Bone Morphogenetic Protein，BMP)是一种具有多种生物学功能的分泌蛋白，是目前发现的唯一一种能够单独诱导间充质细胞分化为骨组织的生长因子。BMP信号通路由三部分组成:分布在细胞外基质中的BMP配体、在细胞膜表面跨膜的BMP受体以及细胞内的SMAD蛋白。BMP信号通路参与细胞增殖与凋亡，在骨骼发育过程中起至关重要的作用，该通路的异常可导致多种骨骼相关疾病的发生。
SMOC2(SPARC-related modular calcium-binding protein 2)基因位于6q27，全长232kb，包含13个外显子。该基因的编码产物SMOC2蛋白是一种分泌蛋白，主要存在于细胞外基质中，最早在关节软骨外细胞基质中被发现。SMOC2及SMOC家族的蛋白中都含有细胞外钙结合结构域(Extracellular Calcium-binding domain，EC domain)，该结构域具有重要的生物学功能。SMOC蛋白可通过EC结构域与胶原蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(heparan sulfate proteoglycan，HSPG)和整合素等进行结合。研究表明SMOC蛋白与HSPG的相互作用可影响BMP信号通路。除此之外，SMOC2还参与多种生物过程，包括胚胎发育、细胞周期、细胞粘附、组织纤维化和钙化、血管形成以及肿瘤的发生发展。
研究目的
1.分离鉴定多发性骨骺发育不良家系的致病基因;
2.利用小鼠模型验证SMOC2基因变异的致病性;
3.探究SMOC2基因变异导致骨骺发育不良的致病机制。
研究方法
1.采集MED家系成员血液样本，提取DNA，通过STR连锁分析检测已知致病基因是否为该家系的致病基因，在排除已知基因后，对该家系的Ⅱ-7、Ⅲ-14和Ⅳ-9进行全外显子组测序以发现新的致病基因。
2.构建突变型Smoc2基因敲入(knock-in)小鼠模型，利用X光测量小鼠身长，使用游标卡尺测量小鼠股骨和胫骨长度，应用micro-CT检测膝关节形态、骨密度和骨量，通过透射电子显微镜观察软骨细胞的超微结构。制备小鼠胫骨石蜡切片后，通过苏木素-伊红染色、番红固绿染色、免疫染色和脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)检测骨骺生长板的形态和软骨细胞的增殖、分化肥大、凋亡情况以及相关标志物的表达水平。
3.构建野生型和突变型SMOC2基因病毒表达载体以及稳定过表达野生型和突变型SMOC2基因的细胞系，通过蛋白免疫印迹(Western blot，WB)检测BMP信号通路和MAPK通路相关分子的表达水平，利用免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation，Co-IP)、固相结合实验(Solid Phase Binding Assay，SPBA)和基于邻位连接技术的Duolinkproximityligationassay(DPLA)实验检测分子间相互作用。
研究结果
1.一多发性骨骺发育不良家系致病基因SMOC2的分离鉴定
我们在山东省临沂市收集到一个多发性骨骺发育不良家系，该家系中每一代都有患者且男女均有发病，符合常染色体显性遗传病的特征。家系中患者均出现了身材矮小和骨关节炎症状，部分患者还有骨化不均匀、骨质疏松等临床表现。本研究首先通过STR连锁分析排除了已知致病基因为该家系致病基因，然后使用全外显子组测序对该家系的Ⅱ-7、Ⅲ14和Ⅳ-9进行检测，并筛选出9个候选致病变异。利用ExAC数据库过滤、保守性分析和Sanger测序验证，初步确定位于SMOC2基因第11外显子的变异(NM_001166412.2:c.1076T＞G，p.L359R)为该家系的候选致病变异。
2.利用小鼠模型确定SMOC2基因变异的致病性
本研究通过胚胎干细胞基因打靶技术，构建mSmoc2knock-in小鼠。首先，对出生后30天(P30)和63天(P63)小鼠的身长、体重进行测量。在P30组和P63组中，mSmoc2knock-in小鼠的平均身长和平均体重均明显小于野生型小鼠。然后，对P30组和P63组小鼠的股骨和胫骨长度进行测量。mSmoc2knock-in小鼠的平均股骨长度和平均胫骨长度也明显短于野生型小鼠。
为了研究mSmoc2knock-in小鼠长骨发育迟滞的原因，我们对小鼠胫骨生长板进行病理学分析。由于P30组小鼠的胫骨生长板已经开始出现缩窄闭合，因此我们选择出生后21天(P21)小鼠进行检测。不论在P21组还是P63组中，mSmoc2knock-in小鼠生长板增殖区在整个生长板中所占比例都要小于野生型小鼠，肥大区所占比例都要大于野生型小鼠。在P21组中，野生型小鼠的生长板增殖区中的软骨细胞排列紧密、整齐，呈柱状分布;mSmoc2knock-in小鼠的生长板增殖区中的软骨细胞排列松散、紊乱，呈柱状分布的较少，部分区域内无软骨细胞。P63组出现了与P21组相同的现象，而且程度更严重。
对P21组小鼠生长板的PCNA检测和小鼠原代软骨细胞的EdU检测结果显示，mSmoc2knock-in小鼠的PCNA和EdU阳性细胞比例低于野生型小鼠。CollagenⅩ和Runx2是肥大软骨细胞标志物，Ihh是前肥大软骨细胞的标志物，这些标志物的表达水平可反映出软骨细胞的分化水平。免疫组织化学染色结果显示，在P21组中，mSmoc2knock-in小鼠的生长板中CollagenⅩ和Runx2蛋白的表达水平明显升高，Ihh蛋白的表达范围明显扩大。实时定量PCR结果显示，在knock-in小鼠的原代软骨细胞中CollagenⅩ基因和Ihh基因的mRNA表达水平明显上调。对P21组小鼠的TUNEL检测发现mSmoc2knock-in小鼠的生长板肥大区内凋亡细胞的数量和比例少于野生型小鼠。
为了判断mSmoc2knock-in小鼠是否出现关节炎表现，对12月龄同窝小鼠和经过3个月跑台实验的9月龄同窝小鼠进行micro-CT检查，结果显示杂合型mSmoc2knock-in小鼠关节软骨下骨骨密度和骨量略低于野生型小鼠。膝关节切片的番红固绿染色并未发现杂合型mSmoc2knock-in小鼠膝关节软骨表面侵蚀增多。
3.SMOC2基因变异导致骨骺发育不良的致病机制
因为BMP信号通路在骨发育中起重要作用，BMP信号通路的异常可导致严重的骨骼疾病，所以本研究在体内和体外实验对BMP信号通路进行检测。研究发现过表达SMOC2基因的HEK293细胞系中，SMAD1/5/9的磷酸化水平明显低于对照组;使用BMP2进行刺激后，SMAD1/5/9的磷酸化水平仍然明显低于对照组。过表达突变型SMOC2基因的HEK293细胞系中SMAD1/5/9的磷酸化水平也明显低于对照组。随后，我们用体内实验对mSmoc2knock-in小鼠的Smad1/5/9磷酸化水平进行检测，结果显示mSmoc2knock-in小鼠软骨细胞中Smad1/5/9的磷酸化水平低于野生型小鼠。这说明过表达野生型和突变型SMOC2基因均能抑制BMP信号通路的传导。
为了探究过表达野生型和突变型SMOC2基因抑制BMP信号通路传导的机制，本研究进行了以下实验。在过表达SMOC2基因的HEK293细胞系中，使用WB检测MAPK信号通路的相关分子发现其表达水平没有升高。随后使用活化的BMP受体进行拯救实验，发现SMAD1/5/9的磷酸化水平得到恢复。此后进行的Co-IP实验结果显示野生型和突变型SMOC2蛋白均能与IB型BMP受体(BMPRIB)进行结合。同时，Co-IP和固相结合实验还显示突变型SMOC2蛋白与COL9A1蛋白和HSPG结合能力下降，而与COMP蛋白和MATN3蛋白的结合能力不变。以上结果说明，过表达SMOC2基因抑制BMP信号通路传导的机制是软骨细胞外基质中过量的SMOC2蛋白与BMP受体结合，阻碍了BMP配体与受体的结合，抑制了BMP受体的活化，进而阻断了BMP信号通路的传导。突变型SMOC2基因抑制BMP信号通路传导的机制是EC结构域的变异降低了SMOC2蛋白在软骨细胞外基质分子网络中的结合能力，从而使大量的SMOC2处于游离状态。游离的突变型SMOC2蛋白在细胞膜表面与BMP受体结合，阻碍了BMP配体与受体的结合和BMP受体的活化，进而抑制了BMP信号通路的传导。
创新性和意义
本研究发现了一个导致多发性骨骺发育不良的新的致病基因SMOC2，并明确了位于EC结构域的变异可抑制BMP信号通路的传导，导致增殖区缩窄、肥大区增宽、软骨细胞排列紊乱、细胞密度降低、软骨细胞分化和凋亡异常。这为MED的基因诊断和治疗提供了新的靶点。
多发性骨骺发育不良(Multiple Epiphyseal Dysplasia，MED)(OMIM 132400)是一种骨软骨发育不良疾病，其遗传方式以常染色体显性遗传为主，部分患者为常染色体隐性遗传。现已发现8个致病基因，分别为COMP基因、COL9A2基因、COL9A3基因、DTDST基因、MATN3基因、COL9A1基因、CANT1基因和COL2A1基因。MED的主要临床表现为轻到中度身材矮小和膝、髋等关节的早发性骨关节炎，影像学检查主要表现为骨骺的骨化延迟和形状改变。
骨骺形成于骨干两侧，骺端与骨干之间残留的软骨组织为骺板，也称为生长板(Growth Plate，GP)。生长板内软骨细胞的增殖和分化是维持长骨纵向生长的动力。研究表明，MED的发生通常是由骨骺生长板中增殖区软骨细胞增殖能力下降或异常分化、肥大区软骨细胞凋亡异常或钙化延迟等原因导致成骨异常引起的。
在骨骺生长板中，除了软骨细胞外，还有大量软骨细胞外基质。软骨细胞外基质中的主要成分是胶原纤维和纤维基质。在胶原纤维和纤维基质间含有胶原蛋白(如Ⅸ型胶原蛋白)和非胶原性分子(如Matrilins和COMP)。已知MED致病基因的编码产物均为胶原蛋白或非胶原性分子。它们互相作用形成分子网络，介导胶原纤维和纤维外基质之间相互作用。这种分子网络的失衡在MED及其他骨软骨疾病的发生中起重要作用。
骨形态发生蛋白(Bone Morphogenetic Protein，BMP)是一种具有多种生物学功能的分泌蛋白，是目前发现的唯一一种能够单独诱导间充质细胞分化为骨组织的生长因子。BMP信号通路由三部分组成:分布在细胞外基质中的BMP配体、在细胞膜表面跨膜的BMP受体以及细胞内的SMAD蛋白。BMP信号通路参与细胞增殖与凋亡，在骨骼发育过程中起至关重要的作用，该通路的异常可导致多种骨骼相关疾病的发生。
SMOC2(SPARC-related modular calcium-binding protein 2)基因位于6q27，全长232kb，包含13个外显子。该基因的编码产物SMOC2蛋白是一种分泌蛋白，主要存在于细胞外基质中，最早在关节软骨外细胞基质中被发现。SMOC2及SMOC家族的蛋白中都含有细胞外钙结合结构域(Extracellular Calcium-binding domain，EC domain)，该结构域具有重要的生物学功能。SMOC蛋白可通过EC结构域与胶原蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(heparan sulfate proteoglycan，HSPG)和整合素等进行结合。研究表明SMOC蛋白与HSPG的相互作用可影响BMP信号通路。除此之外，SMOC2还参与多种生物过程，包括胚胎发育、细胞周期、细胞粘附、组织纤维化和钙化、血管形成以及肿瘤的发生发展。
研究目的
1.分离鉴定多发性骨骺发育不良家系的致病基因;
2.利用小鼠模型验证SMOC2基因变异的致病性;
3.探究SMOC2基因变异导致骨骺发育不良的致病机制。
研究方法
1.采集MED家系成员血液样本，提取DNA，通过STR连锁分析检测已知致病基因是否为该家系的致病基因，在排除已知基因后，对该家系的Ⅱ-7、Ⅲ-14和Ⅳ-9进行全外显子组测序以发现新的致病基因。
2.构建突变型Smoc2基因敲入(knock-in)小鼠模型，利用X光测量小鼠身长，使用游标卡尺测量小鼠股骨和胫骨长度，应用micro-CT检测膝关节形态、骨密度和骨量，通过透射电子显微镜观察软骨细胞的超微结构。制备小鼠胫骨石蜡切片后，通过苏木素-伊红染色、番红固绿染色、免疫染色和脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)检测骨骺生长板的形态和软骨细胞的增殖、分化肥大、凋亡情况以及相关标志物的表达水平。
3.构建野生型和突变型SMOC2基因病毒表达载体以及稳定过表达野生型和突变型SMOC2基因的细胞系，通过蛋白免疫印迹(Western blot，WB)检测BMP信号通路和MAPK通路相关分子的表达水平，利用免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation，Co-IP)、固相结合实验(Solid Phase Binding Assay，SPBA)和基于邻位连接技术的Duolinkproximityligationassay(DPLA)实验检测分子间相互作用。
研究结果
1.一多发性骨骺发育不良家系致病基因SMOC2的分离鉴定
我们在山东省临沂市收集到一个多发性骨骺发育不良家系，该家系中每一代都有患者且男女均有发病，符合常染色体显性遗传病的特征。家系中患者均出现了身材矮小和骨关节炎症状，部分患者还有骨化不均匀、骨质疏松等临床表现。本研究首先通过STR连锁分析排除了已知致病基因为该家系致病基因，然后使用全外显子组测序对该家系的Ⅱ-7、Ⅲ14和Ⅳ-9进行检测，并筛选出9个候选致病变异。利用ExAC数据库过滤、保守性分析和Sanger测序验证，初步确定位于SMOC2基因第11外显子的变异(NM_001166412.2:c.1076T＞G，p.L359R)为该家系的候选致病变异。
2.利用小鼠模型确定SMOC2基因变异的致病性
本研究通过胚胎干细胞基因打靶技术，构建mSmoc2knock-in小鼠。首先，对出生后30天(P30)和63天(P63)小鼠的身长、体重进行测量。在P30组和P63组中，mSmoc2knock-in小鼠的平均身长和平均体重均明显小于野生型小鼠。然后，对P30组和P63组小鼠的股骨和胫骨长度进行测量。mSmoc2knock-in小鼠的平均股骨长度和平均胫骨长度也明显短于野生型小鼠。
为了研究mSmoc2knock-in小鼠长骨发育迟滞的原因，我们对小鼠胫骨生长板进行病理学分析。由于P30组小鼠的胫骨生长板已经开始出现缩窄闭合，因此我们选择出生后21天(P21)小鼠进行检测。不论在P21组还是P63组中，mSmoc2knock-in小鼠生长板增殖区在整个生长板中所占比例都要小于野生型小鼠，肥大区所占比例都要大于野生型小鼠。在P21组中，野生型小鼠的生长板增殖区中的软骨细胞排列紧密、整齐，呈柱状分布;mSmoc2knock-in小鼠的生长板增殖区中的软骨细胞排列松散、紊乱，呈柱状分布的较少，部分区域内无软骨细胞。P63组出现了与P21组相同的现象，而且程度更严重。
对P21组小鼠生长板的PCNA检测和小鼠原代软骨细胞的EdU检测结果显示，mSmoc2knock-in小鼠的PCNA和EdU阳性细胞比例低于野生型小鼠。CollagenⅩ和Runx2是肥大软骨细胞标志物，Ihh是前肥大软骨细胞的标志物，这些标志物的表达水平可反映出软骨细胞的分化水平。免疫组织化学染色结果显示，在P21组中，mSmoc2knock-in小鼠的生长板中CollagenⅩ和Runx2蛋白的表达水平明显升高，Ihh蛋白的表达范围明显扩大。实时定量PCR结果显示，在knock-in小鼠的原代软骨细胞中CollagenⅩ基因和Ihh基因的mRNA表达水平明显上调。对P21组小鼠的TUNEL检测发现mSmoc2knock-in小鼠的生长板肥大区内凋亡细胞的数量和比例少于野生型小鼠。
为了判断mSmoc2knock-in小鼠是否出现关节炎表现，对12月龄同窝小鼠和经过3个月跑台实验的9月龄同窝小鼠进行micro-CT检查，结果显示杂合型mSmoc2knock-in小鼠关节软骨下骨骨密度和骨量略低于野生型小鼠。膝关节切片的番红固绿染色并未发现杂合型mSmoc2knock-in小鼠膝关节软骨表面侵蚀增多。
3.SMOC2基因变异导致骨骺发育不良的致病机制
因为BMP信号通路在骨发育中起重要作用，BMP信号通路的异常可导致严重的骨骼疾病，所以本研究在体内和体外实验对BMP信号通路进行检测。研究发现过表达SMOC2基因的HEK293细胞系中，SMAD1/5/9的磷酸化水平明显低于对照组;使用BMP2进行刺激后，SMAD1/5/9的磷酸化水平仍然明显低于对照组。过表达突变型SMOC2基因的HEK293细胞系中SMAD1/5/9的磷酸化水平也明显低于对照组。随后，我们用体内实验对mSmoc2knock-in小鼠的Smad1/5/9磷酸化水平进行检测，结果显示mSmoc2knock-in小鼠软骨细胞中Smad1/5/9的磷酸化水平低于野生型小鼠。这说明过表达野生型和突变型SMOC2基因均能抑制BMP信号通路的传导。
为了探究过表达野生型和突变型SMOC2基因抑制BMP信号通路传导的机制，本研究进行了以下实验。在过表达SMOC2基因的HEK293细胞系中，使用WB检测MAPK信号通路的相关分子发现其表达水平没有升高。随后使用活化的BMP受体进行拯救实验，发现SMAD1/5/9的磷酸化水平得到恢复。此后进行的Co-IP实验结果显示野生型和突变型SMOC2蛋白均能与IB型BMP受体(BMPRIB)进行结合。同时，Co-IP和固相结合实验还显示突变型SMOC2蛋白与COL9A1蛋白和HSPG结合能力下降，而与COMP蛋白和MATN3蛋白的结合能力不变。以上结果说明，过表达SMOC2基因抑制BMP信号通路传导的机制是软骨细胞外基质中过量的SMOC2蛋白与BMP受体结合，阻碍了BMP配体与受体的结合，抑制了BMP受体的活化，进而阻断了BMP信号通路的传导。突变型SMOC2基因抑制BMP信号通路传导的机制是EC结构域的变异降低了SMOC2蛋白在软骨细胞外基质分子网络中的结合能力，从而使大量的SMOC2处于游离状态。游离的突变型SMOC2蛋白在细胞膜表面与BMP受体结合，阻碍了BMP配体与受体的结合和BMP受体的活化，进而抑制了BMP信号通路的传导。
创新性和意义
本研究发现了一个导致多发性骨骺发育不良的新的致病基因SMOC2，并明确了位于EC结构域的变异可抑制BMP信号通路的传导，导致增殖区缩窄、肥大区增宽、软骨细胞排列紊乱、细胞密度降低、软骨细胞分化和凋亡异常。这为MED的基因诊断和治疗提供了新的靶点。