桑树MYBS1基因对糖代谢的调控作用及机制研究

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MYB转录因子家族成员数量庞大,广泛参与植物体内的多种生命活动过程。但由于MYB类转录因子不同家族成员的功能和作用机制存在复杂多样性,MYB转录因子的生物功能及其调节机制仍然不清楚。我们通过对不同发育时期桑椹的转录组分析,发现一种与拟南芥At MYBS1高度同源的MYBS1转录因子在不同发育时期桑椹中的表达存在差异。由于不同发育时期的桑椹含糖量存在明显差异,我们推测该基因可能在桑椹的糖代谢过程中具有一定的调控作用,但具体的功能和作用机制还不清楚。本研究首次从桑树中克隆得到MYBS1基因(命名为Mul-MYBS1),分析了其表达特性,并利用转基因技术研究了其生物学功能和调控机制,明确了Mul-MYBS1蛋白的亚细胞定位,探讨了其核质穿梭机制;同时鉴定了Mul-MYBS1蛋白的互作蛋白质,研究了糖供应状况对其稳定性的影响。研究结果不仅有望为桑树育种提供候选基因,对于揭示桑椹物质代谢调控机制以及深入了解植物MYBS1转录因子的生物功能和作用机制也具有重要意义。本研究的主要结果如下:(1)Mul-MYBS1基因的克隆及其编码蛋白的结构分析。通过对不同发育时期桑椹的转录组及含糖量变化的联合分析,筛选并克隆到了可能参与调控糖代谢过程的MulMYBS1基因,该基因编码的蛋白质包含315个氨基酸,属于MYB转录因子家族中的1R-MYB类别,C末端具有一个含有高度保守的SHAQK(Y/F)·F基序的1R结构域,该蛋白还含有两个保守的核输入相关结构域NLS1和NLS2,两个保守的核输出相关结构域NES1和NES2。(2)Mul-MYBS1基因的功能分析。Mul-MYBS1基因在拟南芥中表达促进了转基因植株根系的生长,增加了侧根数量,同时也促进了地上部分的生长;Mul-MYBS1基因在拟南芥中表达还促进了转基因植株中淀粉的水解,增加了可溶性糖含量,提高了α-淀粉酶3基因(α-Amy3)和己糖激酶基因(HXK1)的表达水平;在不含蔗糖的培养基上,Mul-MYBS1基因在拟南芥中表达可促进转基因拟南芥种子的萌发和根生长,但在含8%蔗糖的培养基上,Mul-MYBS1基因在拟南芥中表达则抑制了种子萌发,转基因植株表现出对糖敏感的表型;另外还发现,Mul-MYBS1基因能增强花青素合成结构基因CHS、ANS、DFR和3GT启动子的表达活性,促进CHS、ANS、DFR和3GT基因的表达,提高糖处理下转基因拟南芥中花青素的积累。(3)Mul-MYBS1基因的表达特性及Mul-MYBS1蛋白的亚细胞定位分析。MulMYBS1基因在桑树各组织中均有表达,其中在叶中表达量最高,青果期桑椹中次之,在紫桑椹和根中表达量较低。克隆得到了Mul-MYBS1基因的启动子(p Mul-MYBS1),发现p Mul-MYBS1的表达活性受ABA、SA和黑暗诱导,受蔗糖和光照抑制。在持续黑暗处理下Mul-MYBS1蛋白定位于细胞核内,但是在持续光照处理下,有部分MulMYBS1蛋白从细胞核转移到了细胞质,处于核质共存状态,表明Mul-MYBS1蛋白具有核质穿梭特性。(4)Mul-MYBS1蛋白的稳定性分析。利用Western Blot技术对持续光照(糖充足)和持续黑暗(糖饥饿)条件下Mul-MYBS1蛋白的稳定性进行了分析,结果表明糖充足的条件下不仅抑制了Mul-MYBS1基因表达,也能影响Mul-MYBS1蛋白的稳定性。(5)Mul-MYBS1互作蛋白的筛选与鉴定。利用酵母双杂交技术筛选得到18个Mul-MYBS1的互作蛋白,通过酵母双杂交实验和双分子荧光互补实验证明了MulMYBS1可以与E3泛素连接酶(RGLG2)、E2泛素结合酶(UBE)、Patellin-3(PATL3)以及富含亮氨酸重复类受体丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(ELEG)互作。
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