【摘 要】
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K亚型禽白血病病毒（Avian leukosis virus subgroup K,ALV-K）是新近出现的一种外源性禽白血病病毒,其从我国各地品种鸡中最先检出,对我国种禽业发展构成严重威胁。目前尚无有效的疫苗与药物治疗该病,因此要加大对其检测监控力度。酶联免疫吸附试验因其效率性、方便性和灵敏度高而被广泛应用于ALV检测。Gp85是不同亚型抗原检测的位点。已有针对其他亚型的抗原检测方法,但通过应用
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K亚型禽白血病病毒（Avian leukosis virus subgroup K,ALV-K）是新近出现的一种外源性禽白血病病毒,其从我国各地品种鸡中最先检出,对我国种禽业发展构成严重威胁。目前尚无有效的疫苗与药物治疗该病,因此要加大对其检测监控力度。酶联免疫吸附试验因其效率性、方便性和灵敏度高而被广泛应用于ALV检测。Gp85是不同亚型抗原检测的位点。已有针对其他亚型的抗原检测方法,但通过应用单克隆抗体对ALV-K进行抗原检测的DAS-ELISA（Dual-sandwich enzyme-linked immunosorbent assay,DAS-ELISA）方法未见报道。本试验扩增ALV-A/B/J/K gp85基因片段,构建重组质粒,应用原核表达技术获得重组蛋白。将ALV-K gp85重组蛋白免疫接种兔,获得多克隆抗体;采用背部皮下注射方式免疫6周龄BALB/c小鼠,制备杂交瘤细胞,建立间接酶联免疫吸附试验（Indirect enzyme-linked immunosorbent assay,I-ELISA）对其进行鉴定,制备单克隆抗体。初步构建针对ALV-K gp85蛋白的DAS-ELISA检测方法,对其敏感性、准确性、重复性、稳定性和实用性等几个方面进行验证。结果表明,本研究扩增出ALV-A/B/J/K gp85基因片段,成功构建重组质粒ALV-B-p ET-32a-gp85,ALV-A/J/K-p Cold-gp85,经IPTG诱导表达,获得以包涵体形式存在的,大小分别为42、53、37和40 k Da的gp85重组蛋白。获得的多克隆抗体效价最高可达5.12×10~5,可与ALV-K及其gp85重组蛋白反应。采用有限稀释法进行3轮筛选,最终获得3株杂交瘤细胞,其产生的单克隆抗体分别命名为5E12、4B10和3F11;其亚类重链分别为Ig G1、Ig G2b和Ig G2a,轻链均为Kappa。单克隆抗体最高效价可达1.024×10~6。IFA和I-ELISA结果显示,5E12与一株ALV-K及其gp85重组蛋白反应;4B10与3F11与一株ALV-A/K及其gp85重组蛋白反应。构建的DAS-ELISA,使用多克隆抗体作为捕获抗体,使用单克隆抗体为检测抗体。抗原检测范围为0.977～2,000.0 ng/m L;500、250和125 ng/m L三个抗原浓度梯度下,测定该方法的抗原回收率的范围分别为92.1%～106.9%、86.7%～97.9%、77.4%～93.4%,回收效率较高,能准确检测样品。在500、250和125 ng/m L三个抗原浓度梯度下进行重复性检测,批内差异性为4.73%～5.71%,批间差异性为3.41%～6.38%,批次差异较低,可重复检测样品。阴阳临界值为0.119。其可在8月内保持检测稳定;其与商品化ALV p27抗原检测试剂盒符合率为88.37%,与PCR检测符合率为90.70%。综上所述,本研究获得了ALV-A/B/J/K gp85重组蛋白。其诱导产生的单克隆抗体和多克隆抗体能与ALV-K及其gp85重组蛋白反应。初步建立的DAS-ELISA检测方法,可用于ALV-K的监测和控制,为其流行病学调查提供技术支持。
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