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禽白血病是由逆转录病毒科的禽白血病病毒（Avian leukosis virus,ALV）感染所致的一种传染性肿瘤疾病,给全球养禽业造成了巨大的经济损失。根据病毒囊膜糖蛋白的特性不同,可将ALV分为A-K共11个亚群,其中J亚群ALV（ALV-J）被认为是对我国养禽业危害最为严重、流行最为广泛的病毒亚群。垂直传播和水平传播是ALV在鸡群中传播的重要途径,接种了污染ALV的疫苗也是造成该病传播的途径之一。迄今为止,还没有能够用于有效抑制ALV复制的解决方法。此前研究发现,逆转录酶抑制剂Zidovudine（AZT）可以抑制ALV的复制,但是药物对细胞毒性随着药物浓度的增加而增加,而且ALV在长期AZT选择压力下产生耐药性。为此,本研究希望建立一种低毒性的高效抑制ALV解决方案,提出了两种基于逆转录酶基因区域RNAi抑制ALV-J复制的新策略。1.shRNA联合AZT抑制ALV-J的体外复制首先,通过CCK-8法测定了不同浓度AZT体外培养系统的细胞毒性,通过剂量效应曲线观察不同浓度AZT对ALV-J的抑制作用,AZT的工作浓度在不超过1μg/m L时,细胞存活率在95%以上,抑制率＞70%。针对ALV-J逆转录酶基因活性区和RNA酶H活性区设计并构建了shRNA表达质粒,验证其对靶基因的沉默效果为60%左右。通过ELISA测定等多种方式比较了AZT和shRNA表达质粒单独或联合对ALV-J的体外抑制作用。对DF-1细胞中ALV-J mRNA的相对表达量检测发现,特异性shRNA转染组及其与AZT联合应用组的相对表达量分别为0.40~0.51、0.028~0.037,表明shRNA和AZT具有协同抑制作用;使用Western blot检测ALV-J囊膜蛋白表达量也证实两者具有类似协同效果。使用Real-time PCR检测DF-1细胞上清中ALV-J的拷贝数,发现相较于sh-NC组的105.126copies/100μL,特异性shRNA转染组病毒拷贝数降低至104.216~104.313copies/100μL,单纯AZT用药组降低至103.443 copies/100μL,而两者联合抑制后病毒拷贝数降低至102.729~102.917 copies/100μL。对细胞上清中p27抗原水平检测发现,sh-NC组细胞上清S/P值为0.62,特异性shRNA转染组为0.32~0.37,单纯AZT用药组为0.30,而特异性shRNA联合AZT组进一步降低至0.18~0.25,而且两者展现出了协同效应（剂量效应曲线左移）。进一步检测前病毒合成情况发现靶向逆转录酶活性域的shRNA比靶向RNase H活性域的shRNA具有更好的协同效应。上述结果均表明,shRNA和AZT在抑制ALV-J方面具有良好的效果,但单独使用shRNA的体外抑制效果不如单独使用AZT,在不增加对细胞毒性前提下两者联合使用可以提高对ALV-J的抑制效率。2.金纳米负载siRNA抑制ALV-J的体外复制为实现siRNA的高效递送,基于所设计的靶向逆转录酶活性域shRNA进一步合成了靶向RT基因的（Cy3-）siRNA,并通过使用聚乙烯亚胺修饰的方式使用金纳米粒子负载siRNA（Au@PRP NPs）。激光共聚焦显微镜观察和流式细胞分析表明,Au@PRP NPs组和RNAi MAX组阳性细胞比例分别为92.1%和66.6%,证实制备的Au@PRP NPs能够有效递送siRNA进入DF-1细胞中对ALV-J RNA进行剪切,转染效率优于商品化的转染试剂Lipofectamine RNAi MAX。CCK-8细胞毒性检测发现,与空白对照组相比,金纳米递送组细胞存活率为100%,表明金纳米递送siRNA是安全无毒的。随后,本试验检测比较了纳米投递和传统转染技术投递后病毒RNA相对表达量,Au@PRP NPs递送组的相对表达量降低至0.23~0.26,RNAi MAX递送组的相对表达量降低至0.45~0.52,表明Au@PRP NPs能够在显著抑制ALV-J在DF-1细胞上的复制且效果优于RNAi MAX。应用Real-time PCR检测DF-1细胞上清中ALV-J的病毒RNA拷贝数,发现RNAi MAX递送组由105.525 copies/100μL降低至104.781 copies/100μL,Au@PRP NPs递送组由105.526 copies/100μL降低至104.284 copies/100μL。对细胞上清中p27抗原检测发现,RNAi MAX递送组由1.036降低至0.529~0.579,Au@PRP NPs组由1.044降低至0.272~0.326。上述结果表明,靶向RT基因的siRNA经用金纳米粒子递送后展现出更好的体外抗ALV-J效果,且对细胞毒性低于Lipofectamine RNAi MAX。综上所述,本研究建立了基于RNAi抑制ALV-J体外复制的新方法并创新性提出了RNAi与AZT联合应用增强对病毒抑制作用的新思路,并使用金纳米材料实现了对siRNA高效递送,上述抑制策略在清除疫苗种毒ALV中污染等应用场景中得到了验证,这对于辅助加速ALV净化提供了更多选择策略,也为其他逆转录病毒抗病毒研究提供了参考和借鉴。