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内皮细胞是血管生成的关键细胞,不同组织和器官血管内皮细胞呈现形态和功能的异质性。人们也逐渐认识到,肿瘤组织新生血管内皮细胞与正常组织血管内皮细胞存在差异,但长期以来由于缺乏肿瘤源性微血管内皮细胞系,体外研究肿瘤血管生成时一直都使用源于正常血管内皮细胞甚至内皮细胞样细胞系。因此,分离和培养肿瘤源性微血管内皮细胞在研究肿瘤血管生成机制和抗血管生成药物筛选具有重要意义。脑恶性胶质瘤血管生成极为活跃,是研究肿瘤血管生成的良好材料,但目前尚缺乏供胶质瘤血管生成研究的理想体外内皮细胞系及其培养模型。本研究基于对肿瘤源性内皮细胞异质性和恶性胶质瘤微血管的丰富性,分离、纯化了人脑恶性胶质瘤源性微血管内皮细胞(GDMEC),并进行了传代培养;利用三维细胞培养模型初步观察了血管内皮生长因子(VEGF)对GDMEC在三维胶原基质中小管样结构(tubule-like structure)形成的作用。主要结果与结论如下:1.采用胰酶、胶原酶联合消化法,分离获得人脑恶性胶质瘤微血管片段;利用MACS MicroBeads免疫磁珠内皮细胞分选系统,获得高纯度、可连续传代的GDMEC。具体方法是:胶质瘤组织经胰酶、胶原酶消化后的微血管片段接种在明胶包被的细胞培养瓶中,经8～10天培养以富集内皮细胞。在细胞接近融合时,利用结合CD105单克隆抗体的MACS MicroBeads免疫磁珠特异地分选出内皮细胞,从而获得高纯度的GDMEC。GDMEC的生长曲线显示培养第4～7天为增殖高峰期。2.应用光镜、透射电镜和免疫细胞化学等技术对所获内皮细胞进行了鉴定。纯化GDMEC呈单层片状生长、互不重叠,可见到有孔内皮细胞。透射电镜除见到内皮细胞结构特征包括Weibel-Palade小体、丰富的内质网、线粒体等细胞器外,还见到较多微管和微丝,后者以周边部明显。FⅧ-RAg免疫细胞化学染色显示细胞浆及核周呈阳性反应。形态学及免疫化学结果表明所获GDMEC具内皮细胞属性。3.建立并利用GDMEC三维细胞培养模型,比较观测了所获GDMEC和内皮样本课题受国家自然科学基金资助(编号:30270526,30370552)<WP=8>细胞ECV304在三维胶原基质中小管样结构形成情况。结果显示,GDMEC细胞伸展、变形呈扁平状;细胞之间相互连接,形成小管样结构;不同浓度的VEGF刺激后可加速小管样结构的形成、增加形成数量,并促进小管样结构进一步形成毛细血管样网络,而ECV304细胞缺乏这一特性,提示本研究所获得GDMEC更适合体外研究肿瘤血管生成之用。上述实验结果表明,双酶消化法和免疫磁珠细胞分选技术相结合能有效地获得高纯度GDMEC,且具可传代性、对生长因子VEGF具高度敏感的特性。本研究所获得的内皮细胞为GDMEC进一步克隆建株奠定了基础,所摸索出的GDMEC分离和纯化方法为建立其它实体瘤内皮细胞培养体系也积累了经验。本实验不仅有助于认识肿瘤环境诱导下的内皮细胞异质性,而且为深入研究肿瘤血管生成和抗血管生成治疗提供了更为适用的实验材料和体外模型,目前尚未见同样的报道。