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伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)属于α疱疹病毒亚科,具有嗜神经性,能够侵染宿主后在外周神经系统建立潜伏感染,使宿主终生带毒。PRV病毒粒子由内到外分为双链DNA、衣壳、被膜蛋白、囊膜蛋白四层,其中被膜蛋白又分为内层被膜蛋白和外层被膜蛋白,内层被膜蛋白一般与核衣壳连接,外层被膜蛋白一般与膜蛋白的胞浆区相连接。病毒侵入神经元的过程与侵染大多数培养的传代细胞的过程很相似。首先,在外周神经系统的轴突末端病毒的囊膜蛋白与细胞膜融合,然后核衣壳沿着轴突微管逆行运输到细胞体的细胞核。同时内层被膜蛋白(UL36、 UL37)和US3也能随核衣壳逆行运输至细胞核。但是,病毒粒子由神经元细胞体沿轴突顺行运输至轴突远端的机制存在很大争议,一些学者认为病毒在神经元细胞体完成组装形成成熟病毒粒子沿轴突运输至轴突末端释放,另一部分学者认为病毒的核衣壳和囊膜蛋白分别沿轴突运输至轴突末端,然后在轴突末端完成组装释放。最近发现在海马神经元的轴突起始段(axon initial segment, AIS)的胞浆中存在一个由肌动蛋白和锚定蛋白G构成的“分子筛”(the cytoplasmic filter),像滤网一样阻止一些大分子物质(70KD)在轴突和胞体之间的扩散,但可允许小分子物质(10KD)和某些依赖特定马达蛋白转运的膜蛋白通过,膜蛋白的转运与马达蛋白的驱动力强弱和膜蛋白-马达蛋白复合体的运输效能有关。那么PRV沿轴突逆行运输过程中,病毒蛋白进入细胞体是否也受到神经元“分子筛”的影响?根据以上研究背景,本试验首先构建PRV gB-RFP、PRV VP16-EGFP、PRV EGFP-VP1/2、PRV EGFP-VP26四个重组示踪病毒,观察示踪病毒在轴突中的运输情况。然后在微流体系统(microfluidic chamber system)中体外原代培养鸡胚的脊髓背根神经节细胞,在轴突端接种示踪病毒共聚焦显微镜下观察病毒进入细胞体的情况。主要工作包括：1.示踪病毒的构建计划在PRV的囊膜蛋白gB(UL27)、外层被膜蛋白VP16(UL48)、内层被膜蛋白VP1/2(UL36)、衣壳蛋白VP26(UL35)的C端或N端插入荧光标记基因EGFP或RFP构建构建PRV gB-RFP、PRV VP16-EGFP、PRV EGFP-VP1/2、PRV EGFP-VP26重组示踪病毒。首先以PRV Ea株的野毒基因组为模板分别扩增UL27、UL48、UL36、 UL35基因的上下游同源臂,同时分别以pEGFP-C1和pRFP-C1质粒为模板扩增EGFP和RFP,依次连入pcDNA3.1中构建重组转移质粒。然后与PRV的野毒基因组通过脂质体共转染的方法获得重组病毒,通过几轮筛选和纯化获得纯的示踪病毒。然后通过空斑大小和一步法生长曲线比较几种重组毒与野毒的增殖特性,发现示踪病毒所形成的空斑要明显小于野毒形成的,但是增殖曲线没有区别。2.鸡胚脊髓背根神经节细胞的原代培养选取8-12日龄的鸡胚,在解剖显微镜下获取脊髓背根神经节(DRG),直接接种在DMEM无血清培养液(NGF2.5S,20ng/mL)中进行外植体培养,培养7-10天左右进行观察。同样方法在获得脊髓背根神经节后用0.125%的胰酶消化成单个的细胞,先接种在种植培养液中,24h后更换成饲养培养液,在第3天用阿糖胞苷处理抑制非神经细胞的增殖,作用48h后更换新鲜饲养培养液,培养7-10天左右进行观察。通过间接免疫荧光验证所培养的细胞确实是鸡胚脊髓背根神经节细胞。接种重组示踪病毒观察病毒在神经细胞轴突中运输的情况,发现病毒的蛋白沿轴突运输,其运输方向是双向的,并且呈跳跃式运输。3.微流体系统的建立利用微流体系统(microfluidic chamber system)进行原代培养鸡胚脊髓背根神经节细胞,神经元细胞种植在一个隔间(S室)中,轴突通过细微纹沟延伸到另一隔间(N室)中。DRG细胞在S室中培养5天后即可通过细微纹管进入N室。在N室中接种示踪病毒PRV VP16-EGFP2h后,在激光共聚焦显微镜下观察荧光标记蛋白是否进入细胞体,发现在N室和细微纹管中的轴突中可以很明显的观察到VP16-EGFP的移动,但是不能通过进入S室的细胞体中。