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本论文包括两部分研究工作:1.人肿瘤抑制因子Folliculin的结构与功能研究;2.酯特噻二唑促乳腺癌细胞凋亡分子机制研究。
第一部分:人肿瘤抑制因子Folliculin的发现源自Birt-Hogg-Dubé综合征(简称:BHD综合征),一种罕见的单基因显性遗传病,BHD基因(又称FLCN基因)的缺失或突变直接诱发BHD综合征,这已在小鼠动物实验中得到验证。BHD综合征的主要临床表现为肾囊肿、肾肿瘤、皮肤毛囊瘤、肺囊肿或气胸等,说明FLCN能够抑制mTOR信号途径,抑制细胞增殖,但具体分子机制尚不清晰。本实验室前期工作证实BHD综合征是一种初级纤毛信号异常疾病,同时与mTOR信号关联,但有待进一步获取更为准确的分子机制证据。另外仍需广泛探知FLCN的细胞内生理功能。
本实验室的前期工作已证实FLCN可在驱动蛋白Kinesin-2运载下进入初级纤毛,并确定FLCN与Kinesin-2亚基Kif3A的结合结构域,构建了点突变稳定细胞株。本课题拟进一步通过细胞集落形成实验检测点突变稳表细胞株的细胞集落形成情况,证实FLCN缺失或突变会导致肿瘤发生;同时通过Western Blot(WB)实验检测了在生长初级纤毛的情况下,FLCN与Kif3A结合位点突变时,FLCN不能运载进入纤毛。与正常细胞相比,突变株细胞的mTORC1的表达显著上调,细胞处于增殖状态,但与FLCN缺失细胞相比则增殖能力下降。
本课题还优化FLCN基因构建了原核表达系统,利用亲和层析等纯化方法并获取高纯度(>90%)的FLCN蛋白,为解析三维结构提供了基础。另外,细胞集落实验结果不仅表明FLCN突变或缺失能够形成细胞集落,而且能够抑制锌离子诱导的细胞凋亡。鉴于此,利用生物信息学的方法,预测了FLCN能够和锌离子结合,并推测了结合位2点。利用pGEX-6p-1-GST-FLCN重组质粒表达纯化出了FLCN蛋白,利用Zn-IDA亲和介质证实了FLCN能够和锌离子结合,ICP-MS检测FLCN蛋白结合锌离子数量。此外,FLCN的突变蛋白与锌离子的结合能力下降。这些证据表明锌离子可以与FLCN蛋白结合并调控其功能。
第二部分:据2018年统计结果显示,乳腺癌是女性发病率和死亡率最高的癌症。前期研究表明,乳腺癌细胞中的糖原合成酶3 (Glycogen Synthase Kinase-3,GSK-3)活性异常增加。GSK-3是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,已被鉴定为多种细胞功能的调节因子,参与mTOR信号通路的调控。GSK-3在体内有GSK-3α和GSK-3β两种表达形式。Thiadiazolidinone-8(TDZD-8)是GSK-3β的非ATP竞争性抑制剂,在体外实验中证实能够抑制GSK-3β激酶活性,并能够抑制乳腺癌细胞的增殖。本课题组合成了一种TDZD-8类似物,4-苄基-2-乙氧羰基甲基-1,2,4-噻二唑-3,5-二酮(简称酯特噻二唑;Esteriglusib,EST)可抑制乳腺癌细胞增殖。本课题通过细胞集落形成实验、细胞划痕实验检测了EST对乳腺癌细胞MCF-7集落形成、细胞迁移的影响;通过WB实验检测了EST抗肿瘤分子机制。结果表明, EST以时间和浓度依赖的方式抑制细胞集落的形成以及细胞迁移;EST也是GSK-3β的抑制剂,能够通过Ser9位点的磷酸化抑制GSK-3β的活性;EST可增强FLCN蛋白表达并抑制mTOR信号通路的活性,通过激活caspase 3诱导细胞凋亡。
第一部分:人肿瘤抑制因子Folliculin的发现源自Birt-Hogg-Dubé综合征(简称:BHD综合征),一种罕见的单基因显性遗传病,BHD基因(又称FLCN基因)的缺失或突变直接诱发BHD综合征,这已在小鼠动物实验中得到验证。BHD综合征的主要临床表现为肾囊肿、肾肿瘤、皮肤毛囊瘤、肺囊肿或气胸等,说明FLCN能够抑制mTOR信号途径,抑制细胞增殖,但具体分子机制尚不清晰。本实验室前期工作证实BHD综合征是一种初级纤毛信号异常疾病,同时与mTOR信号关联,但有待进一步获取更为准确的分子机制证据。另外仍需广泛探知FLCN的细胞内生理功能。
本实验室的前期工作已证实FLCN可在驱动蛋白Kinesin-2运载下进入初级纤毛,并确定FLCN与Kinesin-2亚基Kif3A的结合结构域,构建了点突变稳定细胞株。本课题拟进一步通过细胞集落形成实验检测点突变稳表细胞株的细胞集落形成情况,证实FLCN缺失或突变会导致肿瘤发生;同时通过Western Blot(WB)实验检测了在生长初级纤毛的情况下,FLCN与Kif3A结合位点突变时,FLCN不能运载进入纤毛。与正常细胞相比,突变株细胞的mTORC1的表达显著上调,细胞处于增殖状态,但与FLCN缺失细胞相比则增殖能力下降。
本课题还优化FLCN基因构建了原核表达系统,利用亲和层析等纯化方法并获取高纯度(>90%)的FLCN蛋白,为解析三维结构提供了基础。另外,细胞集落实验结果不仅表明FLCN突变或缺失能够形成细胞集落,而且能够抑制锌离子诱导的细胞凋亡。鉴于此,利用生物信息学的方法,预测了FLCN能够和锌离子结合,并推测了结合位2点。利用pGEX-6p-1-GST-FLCN重组质粒表达纯化出了FLCN蛋白,利用Zn-IDA亲和介质证实了FLCN能够和锌离子结合,ICP-MS检测FLCN蛋白结合锌离子数量。此外,FLCN的突变蛋白与锌离子的结合能力下降。这些证据表明锌离子可以与FLCN蛋白结合并调控其功能。
第二部分:据2018年统计结果显示,乳腺癌是女性发病率和死亡率最高的癌症。前期研究表明,乳腺癌细胞中的糖原合成酶3 (Glycogen Synthase Kinase-3,GSK-3)活性异常增加。GSK-3是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,已被鉴定为多种细胞功能的调节因子,参与mTOR信号通路的调控。GSK-3在体内有GSK-3α和GSK-3β两种表达形式。Thiadiazolidinone-8(TDZD-8)是GSK-3β的非ATP竞争性抑制剂,在体外实验中证实能够抑制GSK-3β激酶活性,并能够抑制乳腺癌细胞的增殖。本课题组合成了一种TDZD-8类似物,4-苄基-2-乙氧羰基甲基-1,2,4-噻二唑-3,5-二酮(简称酯特噻二唑;Esteriglusib,EST)可抑制乳腺癌细胞增殖。本课题通过细胞集落形成实验、细胞划痕实验检测了EST对乳腺癌细胞MCF-7集落形成、细胞迁移的影响;通过WB实验检测了EST抗肿瘤分子机制。结果表明, EST以时间和浓度依赖的方式抑制细胞集落的形成以及细胞迁移;EST也是GSK-3β的抑制剂,能够通过Ser9位点的磷酸化抑制GSK-3β的活性;EST可增强FLCN蛋白表达并抑制mTOR信号通路的活性,通过激活caspase 3诱导细胞凋亡。