【摘 要】
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研究背景及科学问题:胰岛素降解酶（insulin-degrading enzyme,IDE）是一种调节发育的多功能锌金属内肽酶,既可发挥蛋白酶活性降解胰岛素、胰高血糖素等从而调节细胞增殖与凋亡,又可通过与其他蛋白的相互作用参与多种生理过程,如与甾醇类激素受体结合调节激素信号转导途径等,其功能障碍可导致糖尿病、阿尔茨海默症等疾病发生,是药物开发的重要靶标。IDE 作用靶标众多,且分布于细胞的不同位置
【基金项目】
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国家自然基金项目（31970464）；
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研究背景及科学问题:胰岛素降解酶（insulin-degrading enzyme,IDE）是一种调节发育的多功能锌金属内肽酶,既可发挥蛋白酶活性降解胰岛素、胰高血糖素等从而调节细胞增殖与凋亡,又可通过与其他蛋白的相互作用参与多种生理过程,如与甾醇类激素受体结合调节激素信号转导途径等,其功能障碍可导致糖尿病、阿尔茨海默症等疾病发生,是药物开发的重要靶标。IDE 作用靶标众多,且分布于细胞的不同位置,其如何改变亚细胞定位从而与不同靶标结合发挥不同功能,具体机制目前尚不清楚。翻译后修饰指修饰基团以共价形式连接在蛋白上,是快速调节蛋白活性及亚细胞定位的重要方式。琥珀酰化修饰是赖氨酸残基上发生的多种酰基化修饰之一,其共价基团来源于三羧酸循环的中间产物琥珀酸,与营养状态密切相关,可改变蛋白质分产量及赖氨酸残基的电荷性质,进而调节蛋白功能,是新兴的翻译后修饰研究热点。据此,提出我们的科学问题,IDE 的亚细胞定位和作用靶标选择会否受到翻译后修饰尤其是琥珀酰化的调节?具体机制如何?变态是昆虫适应环境的一种重要方式,不仅包括从幼虫到蛹外部形态的改变,还涉及幼虫组织细胞程序性死亡和成虫组织重建,且受到甾醇类激素和胰岛素等多种激素的协同调控。变态过程中昆虫体内营养物质和能量状态发生剧烈变化,因而可能会导致蛋白质翻译后修饰水平的显著变化。综上,昆虫变态发育是探索翻译后修饰调节IDE 亚细胞定位及靶标选择的良好模型。因此,本论文拟以鳞翅目完全变态昆虫棉铃虫为研究对象,探索IDE 在昆虫变态发育中的功能及作用机制。研究结果既有助于完善IDE亚细胞定位及上游调控机制,也可为药物开发和害虫防治提供参考。研究结果:我们在棉铃虫中克隆并鉴定了编码胰岛素降解酶的基因,并在大肠杆菌中重组表达,免疫家兔制备了多克隆抗体;利用蛋白免疫印迹检测IDE 在不同组织不同发育阶段的时空表达模式,IDE 主要分布在脂肪体和中肠中,总蛋白水平在取食和变态期无明显差异;利用免疫沉淀纯化中肠和脂肪体中的IDE,免疫印迹检测取食期和变态期不同的翻译后修饰变化,结果显示IDE 琥珀酰化水平在 6 龄变态期明显升高;注射dsRNA在虫体中敲降变态期的IDE,蜕皮激素20-羟基蜕皮酮（20-hydroxyecdysonen,20E）信号通路相关基因的转录受到抑制,幼虫化蛹失败并且死亡。在棉铃虫表皮细胞系中,2μM 20E 可明显诱导 IDE 的琥珀酰化水平升高,但 179 位赖氨酸（K179）位点突变后,IDE 琥珀酰化明显减弱。细胞免疫化学和核质蛋白免疫印迹实验表明,20E刺激后IDE可由胞质易位到细胞核,H.K179的琥珀酰化修饰对这一过程是必须的。随后的蛋白质互作实验表明,琥珀酰化的IDE可与蜕皮激素受体EcRBI结合。结论:蜕皮激素20E可在变态期诱导IDE第179位赖氨酸发生琥珀酰化修饰,琥珀酰化的IDE可由细胞质易位进入细胞核,并与蜕皮激素受体EcRBl结合,促进20E信号途径进而促进棉铃虫变态发育。研究结果提供了激素在翻译后修饰水平调节IDE亚细胞定位进而作用于特定靶标的证据,在理论和应用方面都具有参考价值。
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