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蛋白质翻译后修饰是表观遗传学的重要内容,赖氨酸可逆乙酰化修饰由于同组蛋白修饰、热量限制、细胞凋亡、寿命延长和转录沉默等生理过程密切相关逐渐成为人们研究的热点。近年来,有关真核生物的乙酰化调控研究成果日新月异,而原核生物的乙酰化调控研究由于手段的缺乏和基础的薄弱几乎是处于停滞不前的状态。 本论文利用赖氨酸乙酰化抗体的特异性,结合免疫沉淀和质谱技术的高效分离特性,首次对原核生物Salmonellaenterica的乙酰化底物蛋白进行了蛋白组学水平的扫描,揭示乙酰化修饰与各种代谢关系密切;以可发酵碳源葡萄糖和不可发酵碳源柠檬酸为碳源,研究乙酰化修饰与不同代谢途径之间的关系,并且从表型、生化和遗传三个水平深入研究了乙酰化修饰对S.enterica中心代谢的调控机制,首次揭示赖氨酸可逆乙酰化修饰是中心代谢在整体水平上的一种调控方式;同时结合我们合作实验室关于真核生物乙酰化修饰的研究结果,提出赖氨酸可逆乙酰化修饰是一种广泛存在于真核和原核生物中的非常保守的中心代谢的调控机制。 整个研究分为以下四个部分展开。 第一部分我们利用免疫沉淀的高灵敏性富集赖氨酸乙酰化肽段,并利用质谱技术的高分辨率,首次对原核生物S.enterica的赖氨酸乙酰化修饰底物蛋白在蛋白组学水平上进行了扫描研究,得到一系列与能量代谢、转录调控、氨基酸和核酸合成等密切相关的乙酰化修饰底物蛋白。本试验结果发现有166个蛋白的190个肽段是乙酰化的,且其中的77个蛋白是与代谢相关的,这大大超出了我们对乙酰化修饰的预期,为原核生物的乙酰化研究开辟了一个新的天地。 第二部分我们采用Red重组技术成功获得了S.enterica的乙酰基转移酶(Pat)和/或去乙酰化酶(CobB)缺失的突变株,并对它们在葡萄糖和柠檬酸为唯一碳源的基本培养基上的生长表型进行了研究,结果发现S.enterica及其衍生菌株在不同碳源基本培养基中展示出截然不同的生长表型,确认了乙酰化修饰与S.enterica能量代谢之间的密切关系,并提出乙酰基转移酶(Pat)和去乙酰化酶(Cobb)可能是目前唯一已知的能够对S.enterica中心代谢关键酶起可逆乙酰化修饰调控的乙酰化修饰酶。 第三部分我们克隆并表达了乙酰基转移酶(Pat)和去乙酰化酶(CobB)以及中心代谢关键酶,如3-磷酸甘油醛脱氢酶(GapA)、异柠檬酸脱氢酶激酶,磷酸化酶(AceK)和异柠檬酸裂解酶(AceA),并在体外重构Pat/CobB介导的乙酰化/去乙酰化修饰体系,研究乙酰化修饰对这些酶活性的调控方式;同时构建GapA、AceK和AeeA乙酰化修饰位点的点突变蛋白和敲除突变株,体外测定酶活力变化,研究这三个酶的具体乙酰化修饰位点,并进行表型互补试验。结果发现GapA的脱氢酶活力与乙酰化修饰正相关,而AceK的激酶活力和AceA裂解酶活力与乙酰化修饰负相关,且GapA的第108、115、321和331位赖氨酸,AceK的第72、83和553位赖氨酸,AceA的第13和308位赖氨酸与乙酰化修饰密切相关。 第四部分我们以核糖体RNA16SrRNA为内参基因,利用定量荧光实时PCR研究乙酰基转移酶(Pat)和去乙酰化酶(CobB)的转录与不同代谢途径乙酰化修饰之间的关系,结果显示:在葡萄糖为碳源的情况下,pat和cobB的转录水平要高于柠檬酸为碳源;不管是葡萄糖还是以柠檬酸为碳源,对数期pat和cobB的转录水平均要高于它们在稳定期和迟滞期的转录水平;提出存在一个乙酰化潜能(patmRNA/cobBmRNA)的概念,即pat和cobb的转录水平决定了不同时期的乙酰化修饰水平。通过qRT-PCR试验,在转录水平验证了乙酰化修饰与不同碳源代谢之间的相互关系。 综上所述,本论文综合乙酰化修饰在生理、生化和遗传三个方面的证据,验证了乙酰化修饰是一种广泛存在于原核生物S.enterica中的调控方式;提出S.Enterica不同代谢通路转换的分子机制是通过乙酰基转移酶(Pat)和去乙酰化酶(CobB)的共同作用,对中心代谢关键酶类如GapA,AceA和AceK等进行可逆的乙酰化修饰,从整体水平上调控中心代谢;结合我们合作伙伴在真核生物中的研究结果,我们认为代谢关键酶类赖氨酸残基的可逆乙酰化修饰不管是在原核生物还是在真核生物中,在进化上都是一种非常保守的调控机制。 以上结果为原核生物的乙酰化修饰研究开辟了一个新的领域。