论文部分内容阅读
大豆过敏对人类和动物的健康都有严重危害,β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白是大豆中的主要抗原蛋白。猪肠道上皮细胞（IPEC-J2）被用作肠道上皮的体外模型,以研究不同浓度的β-伴大豆球蛋白及大豆球蛋白的作用,从而验证所涉及的信号通路。将未经处理的细胞作为对照组,并添加1、5或10 mg·mL-1的β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白或5 mg·mL-1的β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白和1μmol·L-1核因子-κB（NF-κB）抑制剂（PDTC）,诱导型一氧化氮合酶（iNOS）抑制剂（L-NAME）,c-Jun N端激酶（JNK）抑制剂（SP600125）或p38抑制剂（SB202190）孵育24小时,抑制剂组预处理30分钟,培养完成后,收集细胞培养上清液和细胞裂解上清液,超声后检测各指标。通过CCK8试剂检测细胞活性;ELISA检测IPEC-J2细胞的细胞因子,Caspase-3/-8和COX-2表达水平;用碱性磷酸酶检测试剂盒检测细胞培养上清液中的碱性磷酸酶活性;用JEM-1230透射电子显微镜拍摄图像;通过Western blot,qRT-PCR和免疫荧光检测IPEC-J2细胞的紧密连接（TJ）蛋白（occludin,claudin-1和ZO-1）;免疫荧光法检测IPEC-J2细胞的细胞骨架;qRT-PCR检测NF-κB,iNOS,JNK和p38及其下游基因的mRNA表达;Western blot检测丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）/NF-κB相关蛋白的表达。通过电泳迁移率变动分析（EMSA）检测NF-κBp65,CREB和AP-1 DNA结合活性。试验结果如下:1.加入β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白后,细胞活性明显降低（P<0.01）。然而,与5mg·mL-1β-伴大豆球蛋白组相比,5 mg·mL-1β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白+1μmol·L-1抑制剂（PDTC,L-NAME,SP600125,SB202190）组中,细胞活性显著增加（P<0.05或P<0.01）。2.在IPEC-J2细胞中加入β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白后,细胞因子、Caspase-3/-8和COX-2水平显著提高（P<0.01）;但是,与5 mg·mL-1β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白组相比,它们的水平在5 mg·mL-1β-伴大豆球蛋白+1μmol·L-1抑制剂（PDTC,L-NAME,SP600125,SB202190）组中极显著降低（P<0.05或P<0.01）。3.添加β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白后,碱性磷酸酶活性显著增加（P<0.01）。与5mg·mL-1β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白组相比,1μmol·L-1抑制剂（PDTC,L-NAME,SP600125,SB202190）组细胞培养上清液的碱性磷酸酶活性显著降低（P<0.05或P<0.01）。4.在对照组中,IPEC-J2细胞核完整,染色质均匀分散。在5 mg·mL-1β-伴大豆球蛋白组或大豆球蛋白中,IPEC-J2细胞线粒体改变。在10 mg·mL-1β-伴大豆球蛋白组和大豆球蛋白组中,在细胞核附近观察到小囊泡,细胞核皱缩。与5 mg·mL-1β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白组相比,在5 mg·mL-1β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白+1μmol·L-1抑制剂组IPEC-J2细胞的结构趋于完整。5.β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白处理组IPEC-J2细胞中claudin-1,ZO-1和occludin的蛋白质和mRNA表达显著降低（P<0.01或P<0.05）。与5mg·mL-1β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白组相比,IPEC-J2细胞在5 mg·mL-1β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白+1μmol·L-1抑制剂（PDTC,L-NAME,SP600125,SB202190）组的claudin-1,ZO-1和occludin的蛋白质和mRNA表达显著增加（P<0.01或P<0.05）。6.添加β-伴大豆球蛋白或大豆球蛋白后,与对照组相比,IPEC-J2细胞中紧密连接蛋白（occludin,claudin-1和ZO-1）的免疫荧光信号明显减弱,细胞连接位置减少。与5mg·mL-1β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白组相比,5mg·mL-1β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白+1μmol·L-1抑制剂（PDTC,L-NAME,SP600125,SB202190）组细胞中的紧密连接蛋白（occludin,claudin-1和ZO-1蛋白）更完整。7.1mg·mL-1β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白组的IPEC-J2细胞骨架受到轻微损伤,而5和10 mg·mL-1β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白组的细胞骨架受到严重损伤。但是,在5mg·mL-1β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白+抑制剂（PDTC,L-NAME,SP600125,SB202190）组中,只会对细胞骨架的完整性造成轻微损害。8.添加β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白后,IPEC-J2细胞中NF-κB、iNOS、JNK和p38及其下游基因的mRNA表达显著增加（P<0.01或P<0.05）。抑制剂（PDTC,L-NAME）处理可显著抑制β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白诱导的NF-κB,iNOS,JNK和p38及其下游基因的上调（P<0.01或P<0.05）。9.β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白处理可增加JNK,p38,ERK,NF-κB,c-Fos,c-Jun和IKKα/β的磷酸化水平（P<0.01或P<0.05）。但是,在添加1μmol·L-1的抑制剂（PDTC,L-NAME,SP600125,SB202190）后,这些水平显著降低（P<0.01或P<0.05）。10.添加β-伴大豆球蛋白或大豆球蛋白后IPEC-J2细胞凋亡率显著增高（P<0.01）,并在加入1μmol·L-1的抑制剂（PDTC,L-NAME,SP600125,SB202190）后显著降低（P<0.01）。试验证实,大豆抗原蛋白减少紧密连接的分布并破坏IPEC-J2细胞的细胞骨架,导致细胞凋亡。加入抑制剂后,大豆抗原蛋白诱导的IPEC-J2细胞损伤明显减少。大豆抗原蛋白通过MAPK/NF-κB信号通路对IPEC-J2细胞造成损伤。这项研究的结果对于探索大豆抗原蛋白引起的过敏反应的机制至关重要。