论文部分内容阅读
类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis, RA)是一类常见的系统性慢性自身免疫性疾病，以疼痛、肿胀、持续性滑膜炎，进行性破坏手、脚等小关节，最终导致功能障碍为特点。约有20-30%未接受治疗的RA患者，一年内可能导致永久性功能丧失，严重影响患者的健康和生活质量。大量常规药物如改善病情抗风湿性药(Disease-modifying antirheumatic drugs, DMARDs)和非甾体抗炎药(Nonsteroidal anti-inflammatory drugs, NSAIDs)被广泛用于RA的治疗，然而长期使用后药物的不良反应较大。随着对炎症免疫通路的进一步了解，一些靶向炎性细胞因子如B细胞、T细胞共刺激、肿瘤坏死因子α(Tumornecrosisfactor-α,TNF-α)等的新型药物被用于治疗RA，疗效好的同时也可引起较严重不良反应、广泛免疫抑制，以及诱发恶性感染和肿瘤等，难以长期应用。这些治疗方法还存在对部分RA患者无效或反应低下的情况，或开始阶段有治疗效果，一段时间后出现耐药。引起这些问题的原因多样，而免疫球蛋白D的水平升高可能是原因之一。
免疫球蛋白D(Immunoglobulin D, IgD)包括分泌型IgD(secreted IgD, sIgD)和膜结合型IgD(membrane IgD, mIgD)。许多淋巴细胞和非淋巴细胞表达表面膜受体，其特异性结构位于免疫球蛋白分子的恒定区域(Fc region, FcR),1985年发现IgD受体(IgD receptor, IgDR)在T细胞上表达，IgD可与IgDR结合发挥功能。定量免疫荧光技术显示IgD与T细胞和嗜碱性细胞系结合，IgD可能通过IgDR参与调控T细胞功能。课题组研究发现，sIgD在54例RA患者中的平均浓度为91.93μg/ml，远高于健康对照者(19.8μg/ml)。有文献报道，在约35%的RA患者中发现抗IgD抗体的浓度升高，而对于成年人RA，约有55%的患者血清中抗IgD抗体的浓度明显升高，提示IgD-IgDR可能是治疗针对IgD水平升高的RA患者的一个新靶点。特异性阻断IgD-IgDR信号转导可能成为IgD高水平RA的免疫新疗法。
课题组以IgD-IgDR为靶点，已经成功将人IgD-Fc段与人IgG1-Fc段连接并合成了融合蛋白IgD-Fc-Ig，旨在特异性阻断IgD-IgDR通路，高选择性抑制T细胞的异常增殖与活化，已获得中国发明专利授权(201510600762X)，本课题以RA患者PBMCs为研究对象，检测IgD对RA患者PBMCs功能的作用及IgD-Fc-Ig融合蛋白对IgD上述作用的影响，并通过小鼠建立胶原性关节炎(collagen-induced arthritis, CIA)模型，在整体水平观察IgD-Fc-Ig对CIA小鼠的治疗作用及部分机制。以IgD-IgDR作为新靶点，为IgD-Fc-Ig治疗IgD高水平RA的创新药物研究提供实验依据。
目的：
明确IgD对RA患者PBMCs功能的影响及IgD-Fc-Ig的作用，揭示IgD-Fc-Ig对小鼠CIA的治疗作用及部分机制。
方法：
收集RA患者外周血，通过Ficoll密度梯度离心法得到RA患者PBMCs，CCK-8检测IgD-Fc-Ig对IgD诱导RA患者PBMCs增殖能力的影响；流式细胞术检测IgD-Fc-Ig对IgD诱导RA患者PBMCs表面活化分子(CD4+/CD69+和CD4+/CD154+)百分比和细胞亚群(CD4+/INFγ+、CD4+/IL-4+、CD4+/IL-17+、CD4+/CD25+/FoxP3+)百分比的影响；QPCR技术检测IgD-Fc-Ig对IgD诱导RA患者T细胞特异性核转录因子(Tbet、GATA、RORγt、FoxP3)mRNA表达的影响；ELISA检测CIA小鼠血浆IgD的水平；分析IgD-Fc-Ig组小鼠血浆IgD水平与关节肿胀数、关节炎指数评分的相关性；研究IgD-Fc-Ig对CIA小鼠整体指标(体重、关节肿胀数、关节炎指数)和脾脏及踝关节病理学改变的影响；探讨IgD-Fc-Ig对CIA小鼠胸腺指数和脾脏指数的影响；CCK-8法检测IgD-Fc-Ig对CIA小鼠胸腺T细胞和脾脏B细胞增殖的影响；流式细胞术检测IgD-Fc-Ig对CIA小鼠细胞表面活化分子(CD4+/CD154+)百分比和细胞亚群(CD4+/INFγ+、CD4+/IL-4+、CD4+/IL-17+、CD4+/CD25+/FoxP3+、B220+/IgM+/IgD+)百分比的影响；抗体芯片技术检测IgD-Fc-Ig对CIA小鼠血浆IL-1α、IL-15、MCP-5、MCSF水平的影响；分析IgD-Fc-Ig组小鼠血浆IgD水平与IL-1α、IL-15、MCP-5、MCSF水平的相关性；Westernblot法检测CIA小鼠脾脏Lck、p-Lck、ZAP70、p-ZAP70蛋白表达的影响。
结果：
1.RA患者人口学特征和临床指标
收集33例RA患者，男女比例为6：27，年龄(age, years)、类风湿因子(RF, IU/ml)、C反应蛋白(CRP, mg/L)、红细胞沉降率(ESR, mm/h)及抗环瓜氨酸多肽(Anti-CCP, RU/ml)的均数±标准误值分别为57.24±2.07、171.1±23.8、36.71±5.903、64.7±4.872、683.9±55.04。
2.IgD及IgD-Fc-Ig对RA患者T细胞功能的影响
IgD(3μg/ml)刺激48h后可显著促进RA患者PBMCs增殖，IgD-Fc-Ig在10μg/ml时可明显抑制IgD诱导RA患者PBMCs的增殖能力；IgD(3μg/ml)刺激48h后显著增加RA患者T细胞表面活化分子(CD4+/CD69+、CD4+/CD154+)百分比，IgD-Fc-Ig(10μg/ml)能明显降低IgD诱导RA患者CD4+/CD69+和CD4+/CD154+细胞百分比；IgD(3μg/ml)刺激48h后显著增加RA患者Th17(CD4+/IL-17+)细胞百分比，上调RA患者Th17特异性核转录因子ROR-γtmRNA的表达，降低Treg(CD4+/CD25+/FoxP3+)细胞百分比，下调Treg特异性核转录因子FoxP3mRNA的表达。IgD-Fc-Ig(10μg/ml)显著降低IgD诱导RA患者Th17细胞百分比，IgD-Fc-Ig(3,10μg/ml)下调IgD诱导RA患者ROR-γtmRNA的表达；IgD-Fc-Ig(3,10μg/ml)显著升高IgD诱导RA患者Treg细胞百分比，IgD-Fc-Ig(1,3,10μg/ml)上调IgD诱导RA患者FoxP3mRNA的表达。IgD(3μg/ml)刺激48h以及IgD-Fc-Ig对RA患者Th1、Th2细胞百分比及Th1、Th2细胞特异性核转录因子Tbet、GATAmRNA的表达无明显影响。
3.IgD-Fc-Ig对CIA小鼠整体指标的影响
CIA组小鼠体重自d21开始下降，体重变化与正常组体重比较，从d33开始差异显著，一直持续到d44，d44后体重增加与正常组体重增加值比较无明显差异，各给药组间体重变化无明显变化；d33-d54，抗IgD抗体可明显降低CIA小鼠关节肿胀数和关节炎指数，d37-d54，rhTNFR:Fc可明显降低CIA小鼠关节肿胀数和关节炎指数；d47-d54，IgD-Fc-Ig(3.25, 6.5mg/kg)可明显降低CIA小鼠关节肿胀数和关节炎指数；d50后，IgD-Fc-Ig(13mg/kg)也降低CIA小鼠关节肿胀数和关节炎指数，IgD-Fc-Ig(1.625mg/kg)以及IgG1-Fc(13mg/kg)阴性对照组对CIA小鼠关节肿胀数和关节炎指数无明显影响。
4.CIA小鼠血浆IgD水平的变化
与正常组比较，CIA小鼠血浆IgD水平明显升高。
5.IgD-Fc-Ig组小鼠血浆IgD水平与关节肿胀数、关节炎指数的相关性
IgD-Fc-Ig组小鼠血浆IgD水平与关节肿胀数、关节炎指数评分呈负相关，血浆IgD水平高的IgD-Fc-Ig给药组，小鼠关节肿胀数、关节炎指数评分较低，关节肿胀改善较明显。
6.IgD-Fc-Ig对CIA小鼠踝关节脾脏病理变化的影响
与正常组比较，CIA小鼠关节明显可见滑膜组织增生，炎细胞浸润、血管扩张充血、血管翳出现，以及骨或软骨破坏；IgG1-Fc(13mg/kg)和IgD-Fc-Ig(1.625mg/kg)无明显改善作用；IgD-Fc-Ig(3.25, 6.5mg/kg)剂量组、rhTNFR:Fc组以及抗IgD抗体组滑膜细胞增生明显减少，炎细胞浸润、血管充血、血管翳生成等均有明显改善趋势。与正常组比较，CIA鼠可见白髓增生、生发中心出现、红髓增生、淋巴滤泡增生、炎症细胞浸润。IgG1-Fc(13mg/kg)和IgD-Fc-Ig(1.625mg/kg)无明显改善趋势，IgD-Fc-Ig(3.25, 6.5, 13 mg/kg)剂量组、rhTNFR:Fc组以及抗IgD抗体组与模型组比较，淋巴滤泡增生和炎症细胞浸润明显减轻，生发中心减少。
7.IgD-Fc-Ig对CIA小鼠胸腺指数和脾脏指数的影响
与正常组相比，CIA小鼠胸腺和脾脏明显肿大，指数增加。IgD-Fc-Ig(3.25, 6.5, 13mg/kg)剂量组、rhTNFR:Fc组以及抗IgD抗体组对胸腺指数均有明显下调作用，抗IgD抗体组对CIA小鼠脾脏指数有明显下调作用，而IgD-Fc-Ig(1.625mg/kg)、rhTNFR:Fc、IgG1-Fc对脾脏指数没有显著影响。
8.IgD-Fc-Ig对CIA小鼠胸腺T细胞和脾脏B细胞增殖的影响
CIA小鼠T、B淋巴细胞增殖反应明显增高，IgD-Fc-Ig(3.25, 6.5mg/kg)剂量组能明显下调CIA小鼠胸腺T细胞增殖反应，IgD-Fc-Ig(3.25, 6.5, 13mg/kg)剂量组能明显下调CIA小鼠脾脏B细胞增殖反应。IgD-Fc-Ig(1.625mg/kg)对CIA小鼠胸腺T细胞和脾脏B细胞增殖无明显影响。
9.IgD-Fc-Ig对CIA小鼠T细胞亚群、B细胞亚群的影响
与正常组比较，CIA组脾脏总Th细胞(CD3+/CD4+)、表达CD40L的Th细胞(CD4+/CD154+)、Th1细胞(CD4+/IFN-γ+)、Th17细胞(CD4+/IL-17+)以及成熟B细胞(B220+/IgM+/IgD+)比例显著升高，Th2细胞(CD4+/IL-4+)和Treg细胞(CD4+/CD25+/Foxp3+)比例显著降低，IgD-Fc-Ig(3.25, 6.5, 13mg/kg)剂量组可明显下调总Th细胞、表达CD40L的Th细胞、Th1细胞、Th17细胞百分比，IgD-Fc-Ig(3.25, 6.5mg/kg)剂量组可明显上调Th2细胞的百分比，IgD-Fc-Ig(6.5, 13mg/kg)剂量组可明显上调Treg细胞的百分比；IgD-Fc-Ig(3.25, 6.5, 13mg/kg)剂量组可明显下调成熟B细胞的百分比。
10.IgD-Fc-Ig对CIA小鼠血浆IL-1α、IL-15、MCP5、MCSF水平的影响
与正常组比较，CIA小鼠血浆IL-1α、IL-15、MCP5、MCSF表达明显升高，IgD-Fc-Ig(1.625, 3.25, 6.5, 13mg/kg)剂量组可明显下调CIA小鼠血浆IL-1α的表达，IgD-Fc-Ig(1.625, 3.25, 6.5mg/kg)剂量组可明显下调CIA小鼠血浆IL-15的表达，IgD-Fc-Ig(3.25, 6.5, 13mg/kg)剂量组可明显下调CIA小鼠血浆MCP-5和MCSF的表达。
11.IgD-Fc-Ig组小鼠血浆IgD水平与IL-1α、IL-15、MCP-5、MCSF水平相关性
IgD-Fc-Ig组小鼠血浆IgD水平与IL-1α、IL-15水平呈负相关，即血浆IgD水平高IgD-Fc-Ig的给药组，小鼠血浆IL-1α、IL-15水平下降较明显，而与MCP-5、MCSF水平无明显相关性。
12.IgD-Fc-Ig对CIA小鼠脾脏Lck、p-Lck、ZAP70、p-ZAP70蛋白表达的影响
Lck和ZAP70的总蛋白表达在正常组、模型组以及给药组之间无明显差异，而模型组p-Lck和p-ZAP70的蛋白表达明显升高，IgD-Fc-Ig(3.25, 6.5, 13mg/kg)剂量组可明显下调CIA小鼠p-Lck和p-ZAP70的蛋白表达。
结论：
1.IgD可促进RA患者PBMCs的增殖与活化，引起Th17/Treg细胞亚群的失衡，而IgD-Fc-Ig能够下调IgD引起的促细胞增殖、活化作用，恢复IgD所诱导的Th17/Treg细胞亚群的失衡。
2.首次揭示IgD-Fc-Ig对实验性关节炎具有治疗作用，改善CIA小鼠的足爪肿胀和病理学改变，CIA小鼠血浆IgD水平明显升高，且IgD-Fc-Ig组血浆IgD水平与关节肿胀数和关节炎指数评分呈负相关，IgD-Fc-Ig抑制T细胞的异常增殖与活化，并逆转Th1/Th2，Th17/Treg细胞亚群的失衡，下调关节炎小鼠炎性细胞因子和趋化因子的水平，这些作用可能与下调Lck和ZAP70的磷酸化有关。
3.该研究提示，IgD-IgDR可能成为RA治疗的一个新靶点，IgD-Fc-Ig对伴有高IgD水平RA的治疗可能具有重要前景。
免疫球蛋白D(Immunoglobulin D, IgD)包括分泌型IgD(secreted IgD, sIgD)和膜结合型IgD(membrane IgD, mIgD)。许多淋巴细胞和非淋巴细胞表达表面膜受体，其特异性结构位于免疫球蛋白分子的恒定区域(Fc region, FcR),1985年发现IgD受体(IgD receptor, IgDR)在T细胞上表达，IgD可与IgDR结合发挥功能。定量免疫荧光技术显示IgD与T细胞和嗜碱性细胞系结合，IgD可能通过IgDR参与调控T细胞功能。课题组研究发现，sIgD在54例RA患者中的平均浓度为91.93μg/ml，远高于健康对照者(19.8μg/ml)。有文献报道，在约35%的RA患者中发现抗IgD抗体的浓度升高，而对于成年人RA，约有55%的患者血清中抗IgD抗体的浓度明显升高，提示IgD-IgDR可能是治疗针对IgD水平升高的RA患者的一个新靶点。特异性阻断IgD-IgDR信号转导可能成为IgD高水平RA的免疫新疗法。
课题组以IgD-IgDR为靶点，已经成功将人IgD-Fc段与人IgG1-Fc段连接并合成了融合蛋白IgD-Fc-Ig，旨在特异性阻断IgD-IgDR通路，高选择性抑制T细胞的异常增殖与活化，已获得中国发明专利授权(201510600762X)，本课题以RA患者PBMCs为研究对象，检测IgD对RA患者PBMCs功能的作用及IgD-Fc-Ig融合蛋白对IgD上述作用的影响，并通过小鼠建立胶原性关节炎(collagen-induced arthritis, CIA)模型，在整体水平观察IgD-Fc-Ig对CIA小鼠的治疗作用及部分机制。以IgD-IgDR作为新靶点，为IgD-Fc-Ig治疗IgD高水平RA的创新药物研究提供实验依据。
目的：
明确IgD对RA患者PBMCs功能的影响及IgD-Fc-Ig的作用，揭示IgD-Fc-Ig对小鼠CIA的治疗作用及部分机制。
方法：
收集RA患者外周血，通过Ficoll密度梯度离心法得到RA患者PBMCs，CCK-8检测IgD-Fc-Ig对IgD诱导RA患者PBMCs增殖能力的影响；流式细胞术检测IgD-Fc-Ig对IgD诱导RA患者PBMCs表面活化分子(CD4+/CD69+和CD4+/CD154+)百分比和细胞亚群(CD4+/INFγ+、CD4+/IL-4+、CD4+/IL-17+、CD4+/CD25+/FoxP3+)百分比的影响；QPCR技术检测IgD-Fc-Ig对IgD诱导RA患者T细胞特异性核转录因子(Tbet、GATA、RORγt、FoxP3)mRNA表达的影响；ELISA检测CIA小鼠血浆IgD的水平；分析IgD-Fc-Ig组小鼠血浆IgD水平与关节肿胀数、关节炎指数评分的相关性；研究IgD-Fc-Ig对CIA小鼠整体指标(体重、关节肿胀数、关节炎指数)和脾脏及踝关节病理学改变的影响；探讨IgD-Fc-Ig对CIA小鼠胸腺指数和脾脏指数的影响；CCK-8法检测IgD-Fc-Ig对CIA小鼠胸腺T细胞和脾脏B细胞增殖的影响；流式细胞术检测IgD-Fc-Ig对CIA小鼠细胞表面活化分子(CD4+/CD154+)百分比和细胞亚群(CD4+/INFγ+、CD4+/IL-4+、CD4+/IL-17+、CD4+/CD25+/FoxP3+、B220+/IgM+/IgD+)百分比的影响；抗体芯片技术检测IgD-Fc-Ig对CIA小鼠血浆IL-1α、IL-15、MCP-5、MCSF水平的影响；分析IgD-Fc-Ig组小鼠血浆IgD水平与IL-1α、IL-15、MCP-5、MCSF水平的相关性；Westernblot法检测CIA小鼠脾脏Lck、p-Lck、ZAP70、p-ZAP70蛋白表达的影响。
结果：
1.RA患者人口学特征和临床指标
收集33例RA患者，男女比例为6：27，年龄(age, years)、类风湿因子(RF, IU/ml)、C反应蛋白(CRP, mg/L)、红细胞沉降率(ESR, mm/h)及抗环瓜氨酸多肽(Anti-CCP, RU/ml)的均数±标准误值分别为57.24±2.07、171.1±23.8、36.71±5.903、64.7±4.872、683.9±55.04。
2.IgD及IgD-Fc-Ig对RA患者T细胞功能的影响
IgD(3μg/ml)刺激48h后可显著促进RA患者PBMCs增殖，IgD-Fc-Ig在10μg/ml时可明显抑制IgD诱导RA患者PBMCs的增殖能力；IgD(3μg/ml)刺激48h后显著增加RA患者T细胞表面活化分子(CD4+/CD69+、CD4+/CD154+)百分比，IgD-Fc-Ig(10μg/ml)能明显降低IgD诱导RA患者CD4+/CD69+和CD4+/CD154+细胞百分比；IgD(3μg/ml)刺激48h后显著增加RA患者Th17(CD4+/IL-17+)细胞百分比，上调RA患者Th17特异性核转录因子ROR-γtmRNA的表达，降低Treg(CD4+/CD25+/FoxP3+)细胞百分比，下调Treg特异性核转录因子FoxP3mRNA的表达。IgD-Fc-Ig(10μg/ml)显著降低IgD诱导RA患者Th17细胞百分比，IgD-Fc-Ig(3,10μg/ml)下调IgD诱导RA患者ROR-γtmRNA的表达；IgD-Fc-Ig(3,10μg/ml)显著升高IgD诱导RA患者Treg细胞百分比，IgD-Fc-Ig(1,3,10μg/ml)上调IgD诱导RA患者FoxP3mRNA的表达。IgD(3μg/ml)刺激48h以及IgD-Fc-Ig对RA患者Th1、Th2细胞百分比及Th1、Th2细胞特异性核转录因子Tbet、GATAmRNA的表达无明显影响。
3.IgD-Fc-Ig对CIA小鼠整体指标的影响
CIA组小鼠体重自d21开始下降，体重变化与正常组体重比较，从d33开始差异显著，一直持续到d44，d44后体重增加与正常组体重增加值比较无明显差异，各给药组间体重变化无明显变化；d33-d54，抗IgD抗体可明显降低CIA小鼠关节肿胀数和关节炎指数，d37-d54，rhTNFR:Fc可明显降低CIA小鼠关节肿胀数和关节炎指数；d47-d54，IgD-Fc-Ig(3.25, 6.5mg/kg)可明显降低CIA小鼠关节肿胀数和关节炎指数；d50后，IgD-Fc-Ig(13mg/kg)也降低CIA小鼠关节肿胀数和关节炎指数，IgD-Fc-Ig(1.625mg/kg)以及IgG1-Fc(13mg/kg)阴性对照组对CIA小鼠关节肿胀数和关节炎指数无明显影响。
4.CIA小鼠血浆IgD水平的变化
与正常组比较，CIA小鼠血浆IgD水平明显升高。
5.IgD-Fc-Ig组小鼠血浆IgD水平与关节肿胀数、关节炎指数的相关性
IgD-Fc-Ig组小鼠血浆IgD水平与关节肿胀数、关节炎指数评分呈负相关，血浆IgD水平高的IgD-Fc-Ig给药组，小鼠关节肿胀数、关节炎指数评分较低，关节肿胀改善较明显。
6.IgD-Fc-Ig对CIA小鼠踝关节脾脏病理变化的影响
与正常组比较，CIA小鼠关节明显可见滑膜组织增生，炎细胞浸润、血管扩张充血、血管翳出现，以及骨或软骨破坏；IgG1-Fc(13mg/kg)和IgD-Fc-Ig(1.625mg/kg)无明显改善作用；IgD-Fc-Ig(3.25, 6.5mg/kg)剂量组、rhTNFR:Fc组以及抗IgD抗体组滑膜细胞增生明显减少，炎细胞浸润、血管充血、血管翳生成等均有明显改善趋势。与正常组比较，CIA鼠可见白髓增生、生发中心出现、红髓增生、淋巴滤泡增生、炎症细胞浸润。IgG1-Fc(13mg/kg)和IgD-Fc-Ig(1.625mg/kg)无明显改善趋势，IgD-Fc-Ig(3.25, 6.5, 13 mg/kg)剂量组、rhTNFR:Fc组以及抗IgD抗体组与模型组比较，淋巴滤泡增生和炎症细胞浸润明显减轻，生发中心减少。
7.IgD-Fc-Ig对CIA小鼠胸腺指数和脾脏指数的影响
与正常组相比，CIA小鼠胸腺和脾脏明显肿大，指数增加。IgD-Fc-Ig(3.25, 6.5, 13mg/kg)剂量组、rhTNFR:Fc组以及抗IgD抗体组对胸腺指数均有明显下调作用，抗IgD抗体组对CIA小鼠脾脏指数有明显下调作用，而IgD-Fc-Ig(1.625mg/kg)、rhTNFR:Fc、IgG1-Fc对脾脏指数没有显著影响。
8.IgD-Fc-Ig对CIA小鼠胸腺T细胞和脾脏B细胞增殖的影响
CIA小鼠T、B淋巴细胞增殖反应明显增高，IgD-Fc-Ig(3.25, 6.5mg/kg)剂量组能明显下调CIA小鼠胸腺T细胞增殖反应，IgD-Fc-Ig(3.25, 6.5, 13mg/kg)剂量组能明显下调CIA小鼠脾脏B细胞增殖反应。IgD-Fc-Ig(1.625mg/kg)对CIA小鼠胸腺T细胞和脾脏B细胞增殖无明显影响。
9.IgD-Fc-Ig对CIA小鼠T细胞亚群、B细胞亚群的影响
与正常组比较，CIA组脾脏总Th细胞(CD3+/CD4+)、表达CD40L的Th细胞(CD4+/CD154+)、Th1细胞(CD4+/IFN-γ+)、Th17细胞(CD4+/IL-17+)以及成熟B细胞(B220+/IgM+/IgD+)比例显著升高，Th2细胞(CD4+/IL-4+)和Treg细胞(CD4+/CD25+/Foxp3+)比例显著降低，IgD-Fc-Ig(3.25, 6.5, 13mg/kg)剂量组可明显下调总Th细胞、表达CD40L的Th细胞、Th1细胞、Th17细胞百分比，IgD-Fc-Ig(3.25, 6.5mg/kg)剂量组可明显上调Th2细胞的百分比，IgD-Fc-Ig(6.5, 13mg/kg)剂量组可明显上调Treg细胞的百分比；IgD-Fc-Ig(3.25, 6.5, 13mg/kg)剂量组可明显下调成熟B细胞的百分比。
10.IgD-Fc-Ig对CIA小鼠血浆IL-1α、IL-15、MCP5、MCSF水平的影响
与正常组比较，CIA小鼠血浆IL-1α、IL-15、MCP5、MCSF表达明显升高，IgD-Fc-Ig(1.625, 3.25, 6.5, 13mg/kg)剂量组可明显下调CIA小鼠血浆IL-1α的表达，IgD-Fc-Ig(1.625, 3.25, 6.5mg/kg)剂量组可明显下调CIA小鼠血浆IL-15的表达，IgD-Fc-Ig(3.25, 6.5, 13mg/kg)剂量组可明显下调CIA小鼠血浆MCP-5和MCSF的表达。
11.IgD-Fc-Ig组小鼠血浆IgD水平与IL-1α、IL-15、MCP-5、MCSF水平相关性
IgD-Fc-Ig组小鼠血浆IgD水平与IL-1α、IL-15水平呈负相关，即血浆IgD水平高IgD-Fc-Ig的给药组，小鼠血浆IL-1α、IL-15水平下降较明显，而与MCP-5、MCSF水平无明显相关性。
12.IgD-Fc-Ig对CIA小鼠脾脏Lck、p-Lck、ZAP70、p-ZAP70蛋白表达的影响
Lck和ZAP70的总蛋白表达在正常组、模型组以及给药组之间无明显差异，而模型组p-Lck和p-ZAP70的蛋白表达明显升高，IgD-Fc-Ig(3.25, 6.5, 13mg/kg)剂量组可明显下调CIA小鼠p-Lck和p-ZAP70的蛋白表达。
结论：
1.IgD可促进RA患者PBMCs的增殖与活化，引起Th17/Treg细胞亚群的失衡，而IgD-Fc-Ig能够下调IgD引起的促细胞增殖、活化作用，恢复IgD所诱导的Th17/Treg细胞亚群的失衡。
2.首次揭示IgD-Fc-Ig对实验性关节炎具有治疗作用，改善CIA小鼠的足爪肿胀和病理学改变，CIA小鼠血浆IgD水平明显升高，且IgD-Fc-Ig组血浆IgD水平与关节肿胀数和关节炎指数评分呈负相关，IgD-Fc-Ig抑制T细胞的异常增殖与活化，并逆转Th1/Th2，Th17/Treg细胞亚群的失衡，下调关节炎小鼠炎性细胞因子和趋化因子的水平，这些作用可能与下调Lck和ZAP70的磷酸化有关。
3.该研究提示，IgD-IgDR可能成为RA治疗的一个新靶点，IgD-Fc-Ig对伴有高IgD水平RA的治疗可能具有重要前景。