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红皮梨因漂亮的外观特征和富含花青苷的保健功能而得到消费者的广泛接受。但目前品质优良的红皮梨较少,且现有的红皮梨存在着色不稳定、不均匀、着色程度浅等现象。研究红皮梨的相关的生理和分子机制已取得重要进展,但是关于梨果皮色泽的调控网络尚不清楚。本研究从‘八月红’与‘砀山酥梨’杂交F1代中鉴定控制果皮色泽调控的关键基因PyMYB114和与它互作的基因PyERF3。另外,分别从DNA水平(全基因组甲基化分析和SNP位点分析)和RNA水平(表达谱和小RNA分析)探讨‘红早酥’及其绿色芽变的不同组织色泽变异的分子机制。研究结果如下:1.通过QTL定位鉴定R2R3MYB转录因子PyMYB114位于LG5。RNA-seq数据中发现AP2/ERF转录因子PyERF3与PyMYB114共表达,且与梨果实的着色表现出极显著的正相关。超表达PyMYB114的功能鉴定通过瞬时转化烟草,草莓和梨果实能促进花青苷的合成,抑制PyMYB114的表达可以抑制花青苷在红皮梨的合成。通过双荧光素酶报告系统验证共转化PyMYB114,PyERF3和PybHLH3能激活花青苷合成途径的结构基因PyDFR,PyANS和PyUFGT的启动子,增强花青苷的生物合成。进一步通过酵母双杂交试验证明PyMYB114分别与PyERF3和PybHLH3体外互作。因此,提出PyMYB114与PyERF3和PybHLH3形成调控复合体共同调控花青苷生物合成的工作模型。2.以‘红早酥’及其绿色芽色芽变的茎、叶、花和果为材料,采用RNA-seq技术,筛选控制梨色泽变异的关键基因。20个cDNA文库的表达谱测序共获得14.03G的目标序列。约79.05-80.87%的目标序列能成功比对到梨参考基因组。与绿色组织相比,在‘红早酥,的红色组织中鉴定出总共7,650个差异表达基因(DEGs)。DEGs富集到3,799个GO节点和1,110个KEGG代谢途径。其中,48个基因参与类黄酮生物合成和16个基因参与类胡萝卜素生物合成。此外,四个组织有6个共差异表达基因。12个转录因子在茎、叶、果三个组织共表达,主要包括MYB,AP2/ERF,MAC,bZIP和TCP基因家族成员。通过RT-qPCR分析12个基因的表达量与表达谱结果表现一致性,两者的相关系数从0.719到0.974。尤其是参与花青苷转运的PyGSTF12-like与转录因子PyMYB114和PyHY5共表达。进一步通过酵母双杂交和双荧光素酶报告系统证明PyHY5和PyMYB114的互作可以激活‘红早酥’红皮PyGSTF12-like上游启动子,而对‘红早酥’的绿色芽变果皮的PyGSTF12-like启动子的激活能力大大降低。PyHY5和PyMYB114瞬时共转化草莓果实促进草莓表面花青苷的积累。3.本研究通过重亚硫酸盐处理基因组DNA结合高通量测序的方法首次对‘红早酥’及其绿色芽变不同组织(茎、叶、花、果)的全基因组甲基化进行解析。利用IlluminaHiseq2000测序平台获得平均约17～25G的目标序列,73.14～78.25%的目标序列能成功比对到梨的参考基因组。重亚硫酸盐处理的DNA的转化效率高达99.54～99.61%,转化后的胞嘧啶的有效覆盖率达到75.79%。全基因组甲基化水平在染色体上分布是CG,CHG和CHH三种基序分别达到47.81%,32.90%和5.75%。在不同基因区间,内含子最高,其次是mRNA,3’-UTR和CDS差异不大,5’-UTR最低。不同组织CG和CHG甲基化分布特征比较,叶片所占的比例最高(40%～41%),其次是茎(34%～37%)和果皮(33%～36%)花最低33%。CHH甲基化则是果皮最高,其次是花、茎和叶。超甲基化与CG,CHG基序关系密切,而低甲基化与CHH基序有关。甲基化的趋势表现为在转座区间和上下游2k区域积累,在基因本身的区域处于较低水平。甲基化的密度分布特征是CGI最高,其次是mRNA和上游2k启动子,下游2k甲基化密度最低。根据每100bp的窗口至少有6个CG甲基化的要求,筛选出135个差异甲基化区域(DMR)相关的基因。其中,包括两个类黄酮代谢途径相关的基因F3’H和UFGT的启动子区域出现DMR,通过MrcPCR验证,绿皮的甲基化水平远远高于红皮,其中CG最高达到0.92,其次是CHH达到0.907,CHG是0.85。4.本研究采用RNA-seq技术对‘红早酥’及其绿色芽变不同发育时期果皮进行miRNA高通量测序。从4个miRNA文库中鉴定出128个已知的miRNA和449个预测miRNA。通过‘红早酥’与其绿色芽变果皮在不同发育时期的比较,发现36个miRNA在不同发育时期共差异表达。进一步研究,这些差异表达的miRNA预测的靶基因有250个共差异表达。值得关注的是,靶基因除了一些已知功能的转录因子WRKY,SPL,ERF/AP2基因家族的基因,还发现新的转录因子编码的DELLA蛋白和Ankyrinrepeat蛋白可能参与梨果皮花青苷的代谢。