【摘 要】
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目的课题组前期获得一株对雷公藤红素（Celastrol,CSL）具有羟化作用的拟茎点酶LGT-5（Phomopsis sp.）。为了从基因水平解读LGT-5对雷公藤红素生物转化作用的产生,挖掘具有羟化作用的功能基因。对LGT-5全基因组进行测序分析,筛选出对雷公藤红素具有羟化作用的功能基因。采用分子生物学方法,构建功能基因的异源表达体系,验证基因功能。在基因水平深入研究雷公藤红素羟化反应的同时,也
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目的课题组前期获得一株对雷公藤红素（Celastrol,CSL）具有羟化作用的拟茎点酶LGT-5（Phomopsis sp.）。为了从基因水平解读LGT-5对雷公藤红素生物转化作用的产生,挖掘具有羟化作用的功能基因。对LGT-5全基因组进行测序分析,筛选出对雷公藤红素具有羟化作用的功能基因。采用分子生物学方法,构建功能基因的异源表达体系,验证基因功能。在基因水平深入研究雷公藤红素羟化反应的同时,也为雷公藤红素其他生物转化类型的功能基因挖掘提供依据。方法采用Illumina Hi Seq和Pac Bio相结合的测序方法,对LGT-5进行全基因组测序。通过基因组分析,筛选可能参与雷公藤红素羟化作用的功能基因进行异源表达。利用质粒p Czn1构建功能基因表达载体,获得表达载体转化菌株。采用TLC和HPLC-Q-TOF-MS/MS对含有功能基因的转化菌株进行雷公藤红素羟化作用初步验证及分析。结果通过LGT-5全基因组测序分析,获得了约55.07 Mb的基因组序列,GC含量为52.16%。总共预测到16,533个编码基因,平均序列长度为1,662.90 bp,占整个基因组序列长度的49.93%。外显子有45,842个,累计长度占整个基因组序列长度的44.29%,预测了29,309个内含子,累计长度占整个基因组序列长度的5.64%。发现了419个非编码RNA（nc RNA）,占整个基因组长度的0.10%。重复序列的总长度为1,609,591 bp,占基因组长度的2.9230%。共有16,533个基因通过各个数据库得到注释。Anti SMASH预测到LGT-5中存在鉴定出7个次生代谢物基因簇,包括3个T1PKS、1个NRPS、3个Terpene。筛选出2个可能对雷公藤红素具有羟化作用的基因（S1G00375.Trl和S10G12438.Trl）并成功构建异源表达体系。对目的基因进行功能初步验证,并对其发酵反应后的乙酸乙酯萃取物及进行TLC以及HPLC-Q-TOF-MS/MS分析,确定基因S10G12438.Trl为雷公藤红素羟化功能基因。结论LGT-5（Phomopsis sp.）的基因S10G12438.Trl可催化雷公藤红素发生羟化反应。
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