论文部分内容阅读
目的:探究WtCosmc转染及人胎盘间充质干细胞(human placenta derived mesenchymal stromal cells,hPMSCs)对人急性淋巴白血病细胞(Jurkat T)表面标记、细胞因子分泌和O-糖基化的影响,以及WtCosmc转染对Tn+细胞(Jurkat T、LS174T-Tn+)生物学行为、核心3-乙酰葡萄糖氨基转移酶(Core 3β1-3GlcNAc transferase,C3GnT)活性、Apo2L/TRAIL诱导细胞凋亡敏感性的影响及相关机制。方法:1.将hPMSCs与WtCosmc基因转染前后的Jurkat T细胞共培养,采用FCM检测Jurkat T表面CD4、CD8、CD28分子及Tn抗原的表达水平,ELISA检测细胞因子(IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α、IFN-γ)分泌水平;Western blot 检测 Cosmc表达水平,荧光法检测T-合酶活性,CORA检测O-糖组变化。2.将WtCosmc质粒稳定转染Jurkat T细胞和LS174T-Tn+细胞,采用实时无标记动态细胞分析技术检测LS174T细胞增殖和迁移能力,CCK-8和Transwell分别检测Jurkat T细胞增殖和迁移能力,FCM检测WtCosmc转染前后Jurkat T细胞和LS174T细胞对Apo2L/TRAIL诱导凋亡的敏感性;荧光法检测T-合酶活性,CORA检测O-糖组变化。同时,新建C3GnT活性检测方法,检测WtCosmc转染前后Tn+细胞中C3GnT活性变化。结果:1.与hPMSCs共培养及转染WtCosmc后,Jurkat T-Mock细胞表面CD4的表达增加,CD28、Tn的表达减少;Cosmc蛋白表达增多,T-合酶活性增高,表达核心 1 衍生型 O-聚糖结构(m/z:955.4,1316.6);IL-2、TNF-α、IFN-γ 分泌增多,IL-4、IL-10分泌减少。2.WtCosmc 转染后 Jurkat T 细胞(Jurkat T-Cosmc)变为 Tn-细胞,与 hPMSCs共培养后,细胞表面CD4表达增高,CD28表达降低,Tn抗原表达亦降低;Cosmc蛋白表达增多、T-合酶活性增加,O-聚糖结构更为复杂,包括核心1衍生型O-聚糖(m/z:955.4,1129.5和1316.6)及核心2衍生型O-聚糖结构(m/z:1217.6和2058.0);IL-2、TNF-α、IFN-γ 分泌增多,IL-4、IL-10 分泌减少。3.与未使用T细胞活化剂(CD3/CD28免疫磁珠)相比,Jurkat T-Mock细胞经CD3/CD28免疫磁珠刺激后,CD4和CD28表达增加,Tn抗原、Cosmc蛋白表达及T-合酶活性均无明显变化;细胞亦不表达核心1及核心2衍生型的O-聚糖结构;IL-2、TNF-α、IFN-γ 分泌增多,IL-4、IL-10 分泌减少。Jurkat T-Cosmc 细胞经CD3/CD28免疫磁珠刺激后,CD4、CD28及Tn抗原表达升高;Cosmc蛋白、T-合酶活性降低,仍然表达核心1衍生型O-聚糖结构(m/z:955.4,1316.6)。IL-2、TNF-α、IFN-γ分泌增多,IL-4、IL-10分泌减少。4.CD3/CD28 免疫磁珠刺激后 Jurkat T-Mock、Jurkat T-Cosmc 细胞,再与hPMSCs共培养其表面CD4、CD28及Tn表达均降低;Cosmc蛋白、T-合酶活性升高;Jurkat T-Mock细胞表达核心1衍生型O-聚糖结构(m/z:955.4,1316.6),而Jurkat T-Cosmc细胞表达核心1衍生型O-聚糖结构(m/z:955.4,1129.5,1316.6)和核心2衍生型O-聚糖结构(m/z:1217.6)。IL-2、TNF-α、IFN-γ分泌减少,IL-4、IL-10分泌增多。5.与LS174T-Tn-细胞相比,LS174T-Tn+细胞具有更高的增殖、迁移能力和较低的凋亡水平。Jurkat T、LS174T-Tn+细胞经WtCosmc转染后不再表达Tn抗原,增殖及迁移能力降低,凋亡率明显增加;对Apo2L/TRAIL诱导细胞凋亡的敏感性增加,且呈现时间依赖和剂量依赖效应。6.Jurkat T、LS174T-Tn+细胞经WtCosmc转染后T合酶活性的增加,均表达核心1衍生型O-聚糖(m/z:955.4和1316.6)。转染的LS174T-Tn+细胞还表达核心2衍生型O-聚糖(m/z:1217.6、1391.6和1578.7),其结构类型和水平低于LS174T-Tn-细胞(m/z:1217.6、1391.6、1565.7、1578.7 和 1940.0)。7.LS174T-Tn+细胞的C3GnT活性低于LS174T-Tn-细胞,Jurkat T细胞无C3GnT活性;核心3衍生型O-聚糖(m/z:996.4)仅出现在LS174T-Tn-细胞中。WtCosmc转染前后Jurkat T和LS174T-Tn+细胞C3GnT活性和核心3衍生型O-聚糖无明显改变。结论:1.hPMSCs和WtCosmc均可通过改变Jurkat T细胞O-糖基化状态影响细胞表面CD4、CD28及Th1型细胞因子的分泌水平;但在T细胞活化剂存在的条件下,hPMSCs可下调WtCosmc转染前后Jurkat T细胞表面CD28表达水平、诱导其分泌高水平的Th2型细胞因子。2.Jurkat T、LS174T-Tn+及 LS174T-Tn-细胞的 O-聚糖的组成存在差异;Jurkat T细胞无C3GnT活性,LS174T-Tn+细胞C3GnT活性明显低于LS174T-Tn-细胞,WtCosmc转染不能改变C3GnT活性,但可通过纠正O-聚糖结构有效降低Tn+肿瘤细胞的恶性行为,增强其对Apo2L/TRAIL诱导凋亡的敏感性。