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富含黄酮类化合物的苦荞,作为药食兼用作物,具有潜在的研究利用价值。研究发现黄酮类化合物具有抗肿瘤、抗氧化、抗衰老、抗菌、抗病毒、免疫调节等保健和药用功能。苦荞中二氢黄酮醇4-还原酶(dihydroflavonol 4-reductase,DFR)和无色花青素还原酶(leucoanthocyanidin reductase,LAR)是其黄酮类物质合成的关键酶,本研究以克隆苦荞二氢黄酮醇4-还原酶(FtDFR)与苦荞无色花青素还原酶(Ft LAR)基因的基础上,通过原核表达与多克隆抗体制备,为研究FtDFR和FtLAR在苦荞次生代谢物累积中的调控机制奠定基础。研究内容及结果如下:(1)以苦荞发育种子的cDNA为模板,通过RT-PCR方法克隆得到FtDFR与Ft LAR编码基因,采用半定量PCR技术分析FtDFR与Ft LAR在苦荞灌浆期不同组织部位(叶、花、茎和种子)的表达量,发现FtDFR在苦荞的叶与花中的相对较高,而FtLAR在苦荞的种子中相对较高。(2)利用生物信息学方法对FtDFR和FtLAR的核酸序列和推导的氨基酸分析,结果表明,FtDFR和FtLAR基因序列全长分别为1026 bp和1068 bp,分别编码341和355个氨基酸,预测得到FtDFR的分子量为38.53 kD,等电点为5.78,Ft LAR的分子量为39.37 kD,等电点为6.36,多序列比对发现,FtDFR蛋白具有辅酶因子NADP(H)结合区域和由26个氨基酸组成的底物特异性结合区域,Ft LAR蛋白具有保守的RFLP、ICCN和THD结构域,系统发育树表明,苦荞与金荞麦DFR和LAR的亲缘关系最近。(3)克隆得到的FtDFR和FtLAR编码基因,将其构建重组表达载体pET47b-FtDFR和pET28a-Ft LAR,转入大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌,IPTG诱导表达FtDFR和FtLAR融合蛋白,优化表达条件,发现FtDFR在宿主细胞中以可溶与不可溶的蛋白形式存在,而Ft LAR在宿主细胞中以包涵体蛋白形式高效表达。(4)利用钴离子螯合层析柱纯化Ft DFR和FtLAR融合蛋白,结果发现咪唑的梯度洗脱(0~20 mmol和20~150 mmol咪唑)方法和包涵体复性技术分别实现了FtDFR和Ft LAR融合蛋白的高效纯化;利用HPLC方法对FtDFR融合蛋白进行体外酶活的鉴定,结果表明FtDFR融合蛋白具有酶的催化活性,可以将DHQ和DHM还原成无色矢车菊色素和无色飞燕草色素。(5)采用切胶免疫技术制备FtDFR和Ft LAR的多克隆抗体,经Western blotting检测,结果表明制备的FtDFR和FtLAR多克隆抗体与其原核表达的融合蛋白和真核种子中的可溶性蛋白杂交显示单一条带,说明成功制备较高特异性的FtDFR和FtLAR多克隆抗体。