【摘 要】
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4-羟基赖氨酸是一种高度通用的药物中间体,可用于合成许多重要的药物,如N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）拮抗剂和HIV蛋白酶抑制剂等,具有抗癌、抗菌和抗病毒等特性和作用。受自然环境因素的影响,在自然界中的4-羟基赖氨酸存在量很少,而传统的化学合成的方法由于存在环境污染以及合成条件和步骤较为困难等问题,因此也很难实现规模化的生产;由此,通过生物酶法催化来生成4-羟基赖氨酸成为目前研究的热点。本论文鉴
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4-羟基赖氨酸是一种高度通用的药物中间体,可用于合成许多重要的药物,如N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）拮抗剂和HIV蛋白酶抑制剂等,具有抗癌、抗菌和抗病毒等特性和作用。受自然环境因素的影响,在自然界中的4-羟基赖氨酸存在量很少,而传统的化学合成的方法由于存在环境污染以及合成条件和步骤较为困难等问题,因此也很难实现规模化的生产;由此,通过生物酶法催化来生成4-羟基赖氨酸成为目前研究的热点。本论文鉴定了来源于Niastella koreensis的赖氨酸4-羟化酶（NkLH4）（Gen Bank No.AEV99100.1）,对其进行了蛋白表达纯化、产物鉴定、酶学性质表征等研究;同时对该酶进行了构效分析以及分子改造等研究。（1）将来源于Niastella koreensis的赖氨酸4-羟化酶（NkLH4）,通过构建重组载体质粒的方法在大肠杆菌BL21（DE3）中实现了高效表达。先后通过镍柱亲和层析、凝胶过滤层析,得到较高纯度（纯度＞95%）的目的蛋白。通过研究该酶的酶学性质,得出NkLH4的最适催化缓冲液为HEPES缓冲液（p H=7.5）,最适催化温度为25°C,最适催化底物为L-赖氨酸。通过高效液相色谱（HPLC）方法对催化产物进行鉴定,证明羟基化赖氨酸产物生成。（2）通过同源序列比对以及分析进化树系统,证明NkLH4是属于Fe（II）/αKG-GDOs酶家族的一种。以黄杆菌属细菌来源的L-赖氨酸4-双加氧酶KDO5（PDB ID:6EUO）作为模板对NkLH4进行同源建模,对NkLH4的结构进行了预测。通过对该酶的三维立体结构进行分析,得到了该酶的催化活性中心是由His173,Glu175和His309这三个氨基酸残基组成的面部催化三联体,其与活性中心的金属铁离子进行配位结合;辅因子αKG与面部催化三联体以及金属离子共同作用形成了八面体结构。（3）通过组合活性中心迭代饱和突变的方法,同时使用NDT简并密码子,对NkLH4构建了突变体文库,通过建立高通量筛选的方法,对突变体文库进行了快速筛选,获得了高活性突变体MT3（Q161N/T162A/F178Y/E260D）。相比较于WT,突变体MT3比酶活提高了4.16倍,Km从0.65下降到0.09,kcat/Km增加了24.97倍。（4）比较了WT和MT3催化活性口袋的差异,由于MT3的催化活性口袋构象更加的开放,对底物造成的阻遏作用会明显减少,使底物在MT3的构象中能够更加顺利的进入催化活性口袋。之后分别将底物L-赖氨酸,辅因子αKG和产物4-羟基赖氨酸对接到两个受体（WT和MT3）的催化活性中心,观察到了WT和MT3对这些配体所存在的不同的构象;将两个对接结构赖氨酸-WT和赖氨酸-MT3分别进行了300ns分子动力学模拟,结果表明,与WT相比,MT3对L-赖氨酸的结合能显著的增加（-36.58 vs.-52.78 kcal/mol）。同时比较了300 ns时间中底物赖氨酸在WT和MT3中不同的运动轨迹;在MT3中,由于氨基酸的突变（Q161N/T162A/F178Y/E260D）形成了一个更加开放的空间,导致氨基酸残基与底物之间的接触频率明显降低了约140倍,减少了其对底物的阻遏作用,导致MT3突变体的酶活性和催化效率更高。
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