N-乙酰氨基葡萄糖是一种重要的功能单糖,具有广阔的市场需求。目前,微生物发酵法成为N-乙酰氨基葡萄糖的重要生产方法,但N-乙酰氨基葡萄糖的生物合成需要与中心碳代谢过程竞争前体物,大量的葡萄糖用于细胞生长代谢,限制了N-乙酰氨基葡萄糖的转化率。本研究以实验室构建的一株Glc NAc生产菌GLA为出发菌,通过敲除pfk A基因,并强化甘油利用途径,实现了葡萄糖、甘油复合碳源利用过程的适当代谢分工,甘油主要进行细胞生长,葡萄糖主要进行N-乙酰氨基葡萄糖合成,提高了复合碳源的利用率与目标产物的转化率,实现了目标产物N-乙酰氨基葡萄糖产量/转化率/生产强度的同步提升。主要内容如下:（1）在GLA菌株中分别进行pfk A、pfk B的单独敲除及同时敲除,不同程度阻碍EMP途径中Glc NAc前体6-磷酸果糖的消耗,使更多的葡萄糖合成目标产物。摇瓶发酵结果显示,以葡萄糖、甘油复合碳源发酵时,pfk A单独敲除菌具有更加持久高效的Glc NAc生产能力,产量达到67.09 g/L。（2）糖酵解途径的部分阻断导致菌体生长出现较长的延滞期,为了进一步提高菌体生长速率,对甘油的利用途径进行了强化。通过对甘油利用途径中的限速关键酶甘油激酶基因glp K进行点突变,提高了甘油利用效率,从而加快了菌体的生长与目标产物的合成。摇瓶发酵结果显示,在以葡萄糖、甘油复合碳源发酵时,glp K点突变菌株发酵48 h,Glc NAc产量达到73.22 g/L,总碳源转化率相比未突变菌株提高了64%。（3）进一步优化复合碳源的比例,当甘油/葡萄糖（m:m）为1:8时,72 h产量达到93.2 g/L,复合碳源的转化率达到49.8%。（4）为确定最佳发酵条件,在5 L发酵罐上的扩大培养,甘油/葡萄糖（m:m）为1:8时,发酵70 h,Glc NAc产量为179.7 g/L,总碳源转化率为0.458 g/g,生产强度为2.57 g/L/h。本研究通过进行葡萄糖、甘油复合碳源的适当代谢分工,成功构建了一株Glc NAc生产菌,实现了Glc NAc产量/转化率/生产强度的同步提升,三种评价指标均为目前报道的最高水平,该策略可以为其它以糖酵解途径的中间代谢物为前体物的异源产物合成提供借鉴。