L-色氨酸作为一种功能多样的芳香族氨基酸,能参与体内多种活性物质及调节因子的合成,因此被广泛应用在食品、药品、动物饲料等领域。随着市场对色氨酸需求加大,色氨酸的合成方法也在不断革新。目前,利用微生物将葡萄糖等廉价原料转化为色氨酸的微生物发酵法已取代化学合成和水解法,成为最有吸引力的生产方法。因此,构建一株高效、稳定的色氨酸工程菌株成为工业生产色氨酸的关键。本研究以一株大肠杆菌色氨酸生产菌SX1为出发菌株,通过代谢工程手段,从多个角度对菌株的色氨酸合成能力进行了优化,其中包括:（1）优化色氨酸操纵子表达;（2）引入外源色氨酸外排蛋白;（3）引入外源E4P合成途径;（4）使用不依赖PEP的葡萄糖转运系统替代大肠杆菌PTS系统;（5）重构PEP-PYR-OAA节点代谢网络。经过上述代谢工程优化,最终获得了一株高效的L-色氨酸生产菌株。具体的,本研究首先探究了过表达色氨酸操纵子对色氨酸合成的影响并发现色氨酸无法高效外排是限制菌株生产能力和菌株生长的原因。为了解决这个问题,本研究从枯草芽孢杆菌中挖掘了一系列外排载体,通过将这些蛋白引入生产菌株发现,基因ywk B编码的外排载体有效提高了菌株的产量和生物量,其结果相比出发菌株分别提高了11.2%和29.7%。该结果证明引入Ywk B能够促进色氨酸的外排,缓解细胞的代谢压力,提高L-色氨酸生产效率。接着,为了提高前体物E4P的供应,本实验探究了整合xfpk基因和tkt A基因的效果。摇瓶结果显示,整合有xfpk基因的菌株L-色氨酸产量和转化率达到10.8 g/L和0.148 g/g,分别提高了9.1%和13.8%,而含有额外拷贝tkt A基因的菌株,L-色氨酸产量和转化率均有下降。在加强E4P供应的同时,提高PEP积累量对色氨酸生产很有利。为此,本研究在敲除磷酸转运系统组成蛋白Pts G的同时,使用不同启动子表达了来自移动假单胞菌的葡萄糖渗透酶Glf和大肠杆菌葡萄糖磷酸化酶Glk来设法保证菌株生长和高效产酸。摇瓶结果显示,含有PM1-12-glf和PM1-12-glk的菌株SX20的L-色氨酸转化率比未替换PTS的菌株高10.8%,证明使用Glf和Glk介导的葡萄糖转运系统替换PTS系统能有效提高L-色氨酸的合成效率。接着,为了将更多的中心代谢的碳流引入色氨酸合成途径,PEP-PYR-OAA节点代谢网络被系统地重构。通过敲除丙酮酸激酶I、过表达PEP羧激酶以及引入来自谷氨酸棒杆菌的丙酮酸羧化酶,在摇瓶发酵条件下,所构建的SX24菌株的L-色氨酸产量和转化率达到了10.9 g/L和0.174 g/g。该结果表明,重构PEP-PYR-OAA节点代谢网络能有效提高L-色氨酸的生产效率。最终,在5-L发酵罐分批补料发酵条件下,SX24菌株可在40 h内生产L-色氨酸41.7 g/L,糖酸转化率为0.227 g/g,是目前报道的色氨酸工程菌株的最高转化率,证明该菌株具有良好的工业价值。