【摘 要】
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目的:建立一种基于Taq Man探针的实时荧光定量检测方法,用于定量检测PER2(Period 2)基因启动子甲基化水平,并初步用于研究髓系白血病患者PER2甲基化水平以及与相关基因表达和细胞增殖、凋亡之间的关系,以期探索PER2基因甲基化在白血病发生发展中的作用。方法:(1)根据Gen Bank数据库检索到的PER2基因序列,选择出PER2基因启动子位置的Cp G序列富集区域。根据亚硫酸氢盐转化
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目的:建立一种基于Taq Man探针的实时荧光定量检测方法,用于定量检测PER2(Period 2)基因启动子甲基化水平,并初步用于研究髓系白血病患者PER2甲基化水平以及与相关基因表达和细胞增殖、凋亡之间的关系,以期探索PER2基因甲基化在白血病发生发展中的作用。方法:(1)根据Gen Bank数据库检索到的PER2基因序列,选择出PER2基因启动子位置的Cp G序列富集区域。根据亚硫酸氢盐转化DNA的规律,设计并合成甲基化和未甲基化的PER2基因的目的序列,构建PER2甲基化阳性和阴性参考物质并制备成10倍倍比稀释浓度的模拟样本。自行设计合成并筛选出特异性最好的引物和探针,建立检测PER2基因启动子甲基化的Taq Man实时荧光定量MSP方法。应用制备的模拟样本对建立的定量检测方法的分析敏感性、分析特异性、准确性及重复性进行评价,并将该方法与普通MSP和基于染料法(SYBR GREEN)的q PCR进行分析敏感性的比较。采用建立的Taq Man实时荧光定量MSP方法和普通MSP方法分别对收集的81例髓系白血病患者的骨髓标本进行检测,并将两种方法检测结果不一致的标本进行焦磷酸甲基化测序,评价其临床检测性能。(2)体外培养AML细胞株HL-60和CML细胞株K562,用不同浓度的去甲基化药物5-aza-2d C对两种细胞株进行处理构建出不同甲基化水平的细胞模型,之后通过建立的Taq Man实时荧光定量MSP方法检测细胞株中的PER2甲基化程度,q PCR方法检测细胞株中PER2、p21、p53、DNMT3A、mi R-217的表达,Western blot技术检测细胞株PER2蛋白水平的表达,CCK-8法检测细胞生长水平,流式细胞术检测细胞凋亡率。结果:本研究建立了检测PER2基因启动子甲基化水平的Taq Man实时荧光定量MSP方法,该方法最低检测下限为6 copies/μL,与普通MSP方法相比具有更高的分析敏感性,其批内和批间重复性的变异系数均小于3%。对81例白血病患者标本进行检测的结果显示本研究所建立的方法具有更高的检出率,并与作为甲基化检测的“金标准”焦磷酸测序方法具有更好的一致性。使用去甲基化药物5-aza-2d C对K562和HL-60处理后,随着药物浓度的增加,PER2甲基化水平不断降低,PER2m RNA和蛋白的表达水平不断升高,DNMT3A的相对表达降低,mi R-217和p21的相对表达升高,细胞生长率逐渐下降,细胞凋亡率逐渐上升。结论:1.本研究建立了检测PER2启动子甲基化水平的基于Taq Man探针的实时荧光定量MSP方法,该方法敏感性高,特异性强,重复性好,可用于临床样本的检测;2.通过去甲基化处理HL-60和K562细胞使其PER2基因启动子甲基化水平降低,可导致PER2表达升高,并同时可抑制细胞生长,促进细胞凋亡。
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