研究背景鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)是发生于鼻咽粘膜的恶性肿瘤,好发于中国华南地区,每100,000人大约有25-50人发病。尽管目前治疗鼻咽癌的治疗手段多样化,但是鼻咽癌的复发和转移导致了治疗的失败和病人的死亡。目前有大量的证据表明,肿瘤细胞中存在着小部分维持着肿瘤细胞生长的群体,这些细胞具有自我分裂和分化的能力。因此这部分细胞通常也被考虑为维持肿瘤细胞生长的根源所在,通常人们把它们命名为肿瘤干细胞(Cancer stem cells, CSCs)或者干细胞样(Stem Cell-like)肿瘤细胞。由于肿瘤干细胞是肿瘤的“本源”,因此寻找出肿瘤干细胞的靶点和针对靶点对其进行干预是治疗肿瘤比较具有建设性的策略。有文章报导上皮间充质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)和肿瘤干细胞有联系,上皮向间充质的转化通常表现为：细胞间的粘附减弱；细胞的形态从上皮的多边形向间充质的梭型转化；同时伴有上皮标志物E-钙(E-cadherin)的表达缺失和间充质标志物Vimenti, snail等的表达上调。越来越多的证据表明EMT是肿瘤细胞转移和迁移的先发条件。而肿瘤干细胞通常兼并着EMT的属性。而原癌基因MYC作为经典的癌基因,已经在很多的肿瘤中发现了MYC的高表达,同时也被证实在肿瘤干细胞的维持上和上皮间充质转化中发挥着重要的作用。但是MYC调控EMT和肿瘤干细胞的分子机理目前还不清楚。然而,我们的研究中发现,MYC在鼻咽癌中进行过表达可以增加肿瘤细胞中侧群(Sidepopulation)的比例和肿瘤球的形成能力以此同时,MYC也可以增加肿瘤细胞的迁移和转移能力。这些结果表明了,MYC可能在鼻咽癌中同样可以影响肿瘤细胞的干性和转移能力。小分子非编码RNA (MicroRNAs)通常具有22个碱基的长度,可以通过靶向结合基因的3’端非编码区域实现对其的调控作用。小分子非编码RNA可以通过调节肿瘤干细胞以及EMT功能相关基因从而对肿瘤干细胞和EMT发挥调节作用。已经证实miR-200c可以靶向Bmil和SUZ12调控EMT和肿瘤干细胞,Bmil的过表达可以过表达EMT调节通路中的重要基因ZEB1, ZEB1可以通过抑制E-Cadherin,同时过表达Vimentin实现对EMT的调控。因此由上可见,miR-200c在对肿瘤干细胞和EMT的调节中起着重要作用。经典的抑癌基因P53可以通过绑定miR-200c的5’端的启动子区域,促进miR-200c的表达,抑制肿瘤干细胞和EMT的发生。P53和miR-200c在人体肿瘤组织中呈正相关的关系并且P53和miR-200c的低表达,病人的预后差,表达增加则预后好。我们的通过使用生物信息学(http://www.biobase-international.com/gene-regulation)的方法预测发现miR-200c的5’端同样具有多个转录子MYC的靶向结合位点。这样的发现,我们在实验中证实了MYC可以通过靶向结合miR-200c的启动子区域抑制其表达。由于MYC的过表达可以抑制miR-200c增加肿瘤细胞的干性(stemness),我们假设抑制MYC可以抑制肿瘤细胞的干性和EMT的特性,而肿瘤干细胞是肿瘤耐药的根本所在,因此抑制MYC可能可以增加肿瘤组织对药物的敏感性。由于肿瘤组织中存在着肿瘤干细胞,并且肿瘤干细胞的存在是肿瘤起源和维持细胞生长的根源。以此同时肿瘤干细胞具有药物耐受的特点,因此有人提出,要治愈肿瘤必须要杀灭肿瘤组织中的肿瘤干细胞。在这样的背景下,我们提出和实施了以下科研策略,通过靶向调控MYC而过表达miR-200c降低肿瘤细胞的干性,从而增加抗肿瘤药物对肿瘤组织,细胞的杀伤作用。研究目的1.明确MYC的表达对干细胞的影响。2.在鼻咽癌中验证miR-200c对肿瘤干细胞以及EMT的调节作用。3.验证转录因子MYC通过靶向作用miR-200c的启动子区域对其实行调节作用。4.探讨MYC对miR-200c的调控作用是否影响了鼻咽癌的干细胞的富集以及EMT。5.研究MYC对miR-200c的调控作用是否对传统化疗药有协助作用。方法细胞和培养条件：本实验所用细胞均由本实验室保存。人鼻咽癌细胞株培养于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基,293T细胞使用含有10%的DMEM培养基,所有的培养基中每200m1均含有青霉素100U/ml,链霉素100μg/ml,于37℃、5%CO2培养箱内培养。肿瘤球培养和分化实验：无血清培养基配制：无血清培养基(serum free medium, SFM)由Ham’s DMEM-F12(1:1)、B27(1:50)、EGF(20ng/ml)、bFGF(20ng/ml)组成,将鼻咽癌SUNE-1,5-8F细胞接种于10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中,待细胞处于对数生长期,用PBS液清洗,胰酶消化,消化后再用PBS清洗两次,细胞计数后置于低粘附培养板中,悬浮于SFM中进行传代培养,观察细胞在SFM中形成肿瘤干细胞球的过程,将于SFM中形成的细胞球重新置于SSM中诱导其分化,48h后倒置显微镜观察细胞形态变化。载体和核酸小分子片段的转染：Both pLKO.1lentiviral shRNA vector and control shRNA targeting所有的pLKO.1慢病毒干扰载体和针对GFP的对照干扰载体均购买自Aldrich-Sigma。在慢病毒shc-Mycl中的MYC干扰载体的靶向序列是：CCTGAGACAGATCAGCAACAA.在慢病毒shc-Myc2中的MYC干扰载体的靶向序列是：CAGTTGAAACACAAACTTGAA。c-Myc的过表达载体是来自美国Fox Chase肿瘤中心。慢病毒载体miR-200c惠赠自Michael F. Clarke (Stanford大学)。miR-200a小分子核酸模拟物,miR-200b小分子核酸模拟物,miR-200c小分子核酸模拟物and miR-200c的核酸抑制剂购买自Genepharma公司(中国,上海)。用来做启动子分析的miR-200c的启动子区域克隆自人的染色体组然后通过使用酶切位点KpnI和NheI接入空白载体pGL4(Promega). miR-200c的荧光素酶载体突变使用的是QuikChange Site-Directed Mutagenesis试剂盒(Stratagene)所有的载体的序列见附表1。所有的载体的转染均使用Lipofectamine2000(Invitrogen)。转染293T细胞48小时候,使用产生的病毒感染目的细胞,感染48小时候收集细胞做实验。免疫荧光：吸取SFM中形成的肿瘤球至24孔板中(肿瘤球样品),或吸取SFM中形成的肿瘤球植入预先放有盖玻片的6孔板中(肿瘤球分化样品),4%多聚甲醛固定,PBS清洗,0.2%Triton X-100破膜,PBS清洗,加入一抗37℃孵育45min,PBS清洗,洗涤后加入荧光二抗,37℃孵育45min, PBS清洗,DAPI染细胞核,在共聚焦显微镜下观察。10×KB配方：0.1M Tris, pH7.5;1.5M NaCl;1.0%BSA。MTT检测：过滤网将大于40tμm的肿瘤球分离出来分离成单个细胞或将对数生长期的贴壁细胞分别接种到96孔板中,每孔2000个细胞,37℃,5%CO2培养箱中培养6h,依浓度梯度加入药物。药物作用完毕后每孔加20μl MTT,继续培养4-5h,将细胞培养液上清弃去,每孔加入200μl DMSO,摇床混匀约5min。酶标仪490nm比色,绘制肿瘤细胞生长曲线。免疫印迹实验总蛋白的提取使用的是RIPA试剂(Sigma-Aldrich),提取的蛋白置入SDS-PAGE电泳胶中,转膜使用的是PVDF纤维膜(Millipore),转膜后封闭于含有05%脱脂奶粉的TBS+0.05%Tween-2封闭液中.没个胶中均含有蛋白失踪显示标记液；封闭后一抗四度过夜,一抗孵育完成后用PBS洗4次*5分钟。二抗孵育一个小时用PBS漂洗4次*5分钟后用显影液显影。生物发光检测仪检测拍照。以下为我们实验中使用的蛋白及来源：c-Myc, Suz-12, Bmi-1, Sox2, E-cadherin, Zeb2, Vimentin, GAPDH (Santa-Cruz Biotechnology).侧群细胞检测：将经过处理后的贴壁细胞消化并重悬为单个细胞,离心后用PBS清洗,含2%胎牛血清的1640培基重悬,用Hoechst33342标记,没1*10的五次方细胞加入Hoechst33342lug标记的细胞在37℃孵育90min, PBS洗涤,重悬,检测前加入Propidium Iodide标记死细胞,采用流式细胞仪检测侧群比例。RNA提取：细胞总RNA提取：细胞消化,离心,弃上清,加入1ml Trizol;室温孵育15min,裂解细胞；4℃,12000rpm离心15min,取上清；每1ml Trizol加入0.2m1氯仿,剧烈振荡15s,冰上孵育15min;4℃,12000rpm离心15min,缓慢取上清,避免吸入中间层的白色物质,上层水相体积约为所用Trizol试剂的60%；将吸取的上清置于另一干净EP管内,加入等体积的异丙醇沉淀水样中的RNA,颠倒混匀,40C,12000rpm离心15min,见RNA沉淀附着于EP管底和侧壁；弃上清,用预冷的75%乙醇(1%DEPC水配制)lml悬浮洗涤沉淀；4℃,7500g离心5min,干燥RNA,用DEPC水溶解沉淀,-80℃保存。免疫组织化学：石蜡切片经脱蜡,乙醇梯度水化,抗原修复,灭活内源性过氧化物酶,一抗4℃孵育过夜,二抗25℃孵育10min, DAB显色,显微镜观察显色,苏木素复染核,盐酸乙醇分化,脱水,透明。克隆形成实验对照载体和c-Myc, miR-200c过表达慢病毒载体感染的鼻咽癌细胞经过计数后每个6孔板中滴入200个细胞。使用1640常规培养12小时或者过夜以后加入药物Cisplatin, Taxol和Adriamycin继续培养16天。再长得比较多的孔的克隆数大于50个是,终止培养,细胞固定并染色拍照。迁移和侵袭实验对照载体和c-Myc, miR-200c过表达慢病毒载体感染的鼻咽癌细胞经过计消化后用RPMT重悬待用。为了分析细胞的侵袭能力。每个8μM大小的纤维生物薄膜中滴入1*105细胞上室使用的是无血清培养基,下室使用的是含有10%胎牛血清的培养基。37度培养18小时候细胞用10%的甲醛固定并染色。没有迁移过纤维膜的细胞用棉花拭去,20倍显微镜(Nikon Eclipse80i)下观察多视野拍照并统计。动物成瘤实验动物实验中我们严格执行了动物伦理学会的规定和南方医科大学的动物试验规范进行操作。6周龄的裸鼠购自南方医科大学,每个老鼠皮下臀部注入1*105的处理后的鼻咽癌细胞细胞接种后每5天测量一次大小。瘤体的大小计算公式为：V(mm3)=(a×b2)/2,其中a代表的是瘤体的长距,b代表的是宽距。当肿瘤达到70mmm3的大小时老鼠随机分成4组,每组的老鼠为3个。miR-200c的使用量是50ng/g,而cisplatin的用量是2μg/g Cisplatin处理了四个周期分别在开始处理后的第6,11,16,21天,周末停药,miR-200c使用了6个周期,每三天一次处理分别在第6,9,12,15,18,21天,所有的瘤体的大小均在处理后的24小时内测量。荧光素酶分析处理后的细胞分别培养与24孔板或者48孔板中。荧光素酶使用的是Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega),并按照实验说明书操作。在转染24-48小时候细胞消化并转移至96孔板中加入Glo-Max Luminometer (Promega)上机检测。本课题所用统计学方法：采用统计软件SPSS13.0对实验结果进行统计学处理和分析,计量资料以均数±标准差(x±s)表示。两组肿瘤体积比较采用两独立样本T检验；肿瘤球形成及直径,ALDH阳性细胞和侧群比例,凋亡检测,动物成瘤时间以及原代细胞肿瘤球数量数据均采用单因素方差分析(One-way ANOVA)比较各组差异,如方差齐性,多重比较采用LSD法；如方差不齐,采用Welch值,多重比较采用Dunnett T3法；在体肿瘤生长曲线的比较采用两因素方差分析(two-way ANOVA)比较各组间差异。P<0.05被认为有统计学差异。结果1. c-Myc和miR-200c在鼻咽癌侧群细胞以及肿瘤球中的表达负相关。(1) miR-200a, miR-200b, miR-200c在鼻咽癌细胞侧群中表达下调,而c-Myc表达上调,c-Myc和miR-200c家族的表达呈负相关关系。(2)在鼻咽癌细胞株CNE1, CNE2中过表达c-Myc均发现侧群的比例增加。(3)肿瘤过表达c-Myc以后也增加了肿瘤球的成瘤比例。2. c-Myc可以在转录水平直接靶向调节miR-200c.(1)通过生物信息学预测,我们发现在miR-200c的5’端启动子区域存在着四个c-Myc的转录调节位点。(2)在鼻咽癌细胞株中转入含有miR-200c5’端启动子区域的luc载体,然后在进行c-Myc的过表达。我们发现过表达c-Myc后细胞中的荧光强度增强。(3)对miR-200c的启动子上的c-Myc结合位点进行突变以后发现c-Myc的调控减弱或者消失。(4)干扰或者过表达c-Myc后对miR-200c的表达产生了影响。3. miR-200c可以调控鼻咽癌细胞株的干性。(1)在鼻咽癌细胞株CNE2中过表达miR-200c发现和肿瘤干细胞干性先关的因子：SUZ12, BMI1, SOX2表达下调。(2)过表达miR-200c可以引起鼻咽癌侧群比例下降。(3)过表达miR-200c可以引起肿瘤球的形成比例下降。(4)免疫荧光结果显示过表达miR-200c可以引起SUZ12, BMI1, SOX2的核表达下降。4. c-Myc对鼻癌细胞干性的影响是通过对miR-200c的调控实现的。(1)EMT也是肿瘤细胞干性的指标之一,过表达miR-200c可以抑制c-Myc诱导的鼻咽癌细胞的EMT的发生。(2) c-Myc通过miR-200c调控下游的SUZ12, BMI1, Vimentin, E-cad等和肿瘤细胞干性相关的基因。(3) c-Myc的过表可以增加鼻咽癌细胞的侵袭能力。(4) c-Myc对侧群细胞的调节是通过对miR-200c的调控实现的。5.非干细胞杀伤的肿瘤药物可以增加肿瘤干细胞的富集,并且可以引起miR-200c的表达下调,c-Myc的表达上调。(1)非干细胞杀伤肿瘤药物并不能杀死肿瘤干细胞,可以引起肿瘤干细胞的富集。(2)干细胞杀伤肿瘤药物同时也可以引起肿瘤球的形成比例增加。(3)干细胞杀伤肿瘤药物以此同时miR-200c的表达下降。(4)MYC,和Vimentin的表达增加,E-cad的表达下降。6.在鼻咽癌细胞株中过表达miR-200c或者抑制MYC均可以增加鼻咽癌细胞株对化疗的敏感性。(1)顺铂,肽素以及阿莫西林对鼻咽癌细胞具有一定的杀伤作用。(2)过表达miR-200c后可以增加顺铂,肽素以及阿莫西林对鼻咽癌细胞的杀伤。(3)或者抑制MYC均可以增加鼻咽癌细胞株对顺铂,肽素以及阿莫西林的敏感性。7.体内实验证实,对miR-200c的过表达可以增加非干细胞杀伤化疗药物的敏感性。(1)在裸鼠实验中证实通常使用miR-200c和顺铂可以杀伤抑制肿瘤的生长。(2)联合使用miR-200c和顺铂可以增加对肿瘤细胞的杀伤和瘤体的抑制作用。(3)免疫印迹实验结果表明miR-200c和顺铂联合可以抑制肿瘤干细胞相关的蛋白的表达。(4)侧群检测发现了miR-200c和顺铂联合使用可以抑制肿瘤组织中的侧群比例。结论：1.我们的实验结果表明在鼻咽癌中MYC可以通过靶向调节miR-200c/ZEB2通路调节鼻咽癌肿瘤细胞的干性。2.在鼻咽癌中使用传统化疗药物并不能杀灭肿瘤干细胞,并且使肿瘤细胞群体中的侧群比例增加,干性增强。3.靶向作用抑制MYC的表达或者增加miR-200c的表达可以降低鼻咽癌细胞中的干性,同时增加化疗药物对鼻咽癌肿瘤细胞的杀伤作用。