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心脏骤停发生后,脑组织缺血缺氧损伤以及心肺复苏后的再灌注损伤,都将造成造成神经元广泛凋亡、坏死,引起相应的神经功能缺损。研究数据表明心肺复苏后存活患者中只有不到5%达到满意的神经功能恢复。有效减轻复苏后神经系统并发症,是一个亟待解决的医学难题,也是长期以来人们探索的重点和热点之一。 远隔缺血后处理(Remote ischemic postconditioning,RIPost)是一种新的器官保护策略,既往研究发现 RIPost能够明显减轻心、脑等器官的缺血再灌注损伤,我们课题组前期研究证明远隔缺血后处理可减轻心肺复苏后脑损伤。然而,RIPost的器官保护机制未完全明确。炎症反应作为心肺复苏后脑损伤的重要发病机制之一,贯穿了整个病理过程的始终,亦是导致神经元损伤的主要原因之一, RIPost对靶器官炎症反应的抑制作用得到了一些实验研究的证实。胆碱能抗炎通路( Cholinergic anti-inflammatory pathway,CAP)以迷走神经、乙酰胆碱及特异的乙酰胆碱受体为基础,激活后可以有效减少多种促炎因子的释放。在有关远隔缺血处理的研究中,发现给予神经节阻断剂或者迷走神经切断会消除缺血处理的脑保护作用,这提示CAP与RIPost很有可能具有一定联系。我们在前期预实验中观察到RIPost不仅能够降低大鼠心肺复苏后海马部位和血液中IL-1β、IL-6以及TNF-α等炎性因子的水平,还能够提高脑乙酰胆碱(Acetylcholine,Ach)的水平,颈迷走神经切断后,RIPost脑保护作用明显减弱。 因此,本课题研究胆碱能抗炎通路是否参与了RIPost减轻心肺复苏脑损伤,不仅为心肺复苏后脑损伤探索新的、具有临床意义的治疗思路,而且为 RIPost的脑保护作用提供新的理论依据,更为研发调控神经炎症发挥脑保护作用的药物提供新的靶点。 实验一远隔缺血后处理对心肺复苏后脑损伤炎症反应的影响 目的:探讨RIPost对大鼠心肺复苏后脑损伤炎症反应的影响。 方法:雄性SD大鼠69只,随机分为5组:假手术组(sham组,n=9)、对照组(control组,n=15)、远隔缺血后处理A组(RIPost_A组,n=15)、远隔缺血后处理B组(RIPost_B组,n=15)、远隔缺血后处理C组(RIPost_C组,n=15)。sham组大鼠仅行气管插管及动静脉穿刺,control组大鼠窒息8 min后复苏,RIPost_A组大鼠在自主循环恢复(ROSC)后即刻用止血带对右下肢行3个循环的后处理,每个循环结扎与开放均持续15 min,RIPost_B组大鼠在ROSC后即刻及3h对右下肢各行3个循环结扎与开放,RIPost_C组在ROSC后即刻、3h及6h对右下肢各行3个循环结扎与开放。观察复苏成功率;采用ELISA法检测ROSC后1h(T1)、8h(T2)及24h(T3)血浆IL-1β、TNF-α及HMGB-1水平,ROSC后24h大鼠皮层及海马组织IL-1β、TNF-α及HMGB-1含量,ROSC后48h血清神经元特异性烯醇化酶(NSE)浓度;ROSC后1d、3d、5d及7d行神经元缺损评分(NDS);ROSC后4d行Morris水迷宫实验;采用Nissl染色法计算ROSC后8d大鼠海马CA1存活神经元数目。 结果:与sham组相比,control组及RIPost_A-C组各时间点NDS评分及降低;血浆、皮层及海马IL-1β、TNF-α、HMGB-1及NSE浓度升高;海马CA1区神经元数目减少,结构不清;逃避潜伏期延长,靶象限停留时间及穿越平台次数降低(P<0.05)。与control组相比,RIPost_A-C组各时间点NDS评分升高;血浆、皮层及海马IL-1β、TNF-α、HMGB-1及NSE浓度降低;海马CA1区神经元数目增加,损伤程度减轻;逃避潜伏期缩短,靶象限停留时间及穿越平台次数升高(P<0.05)。与RIPost_A组相比,RIPost_B-C组1d NDS评分升高;血浆T2,T3时间点IL-1β、TNF-α、HMGB-1及NSE浓度降低;海马CA1区神经元数目增加,损伤程度减轻(P<0.05);其余指标无统计学差异(P>0.05);RIPost_B与RIPost_C组各检测指标无统计学差异(P>0.05)。 结论:远隔缺血后处理降低炎症反应,减轻大鼠心肺复苏后脑损伤;复苏后6h远隔缺血后处理抗炎作用减弱,不能增强其对大鼠心肺复苏后脑损伤的保护作用。 实验二远隔缺血后处理对心肺复苏后Ach及α7nAChR的影响 目的:观察远隔缺血后处理对心肺复苏后Ach和α7nAChR表达的影响,探索其脑保护作用与胆碱能抗炎通路的联系。 方法:雄性SD大鼠26只,随机分3组:假手术组(sham组,n=6)、模型组(CA组,n=10)、远隔缺血后处理组(RIPost组,n=10)。sham组气管插管及动静脉置管, CA组窒息8min后复苏,RIPost组在ROSC后即刻及3h以止血带对右下肢各行3个循环的后处理。ELISA法检测ROSC24h血浆及脑组织Ach含量,western blot法检测ROSC24h脑组织α7nAChR表达,免疫荧光染色检测ROSC24h脑组织α7nAChR与NeuN,CD11b及GFAP的共表达。 结果:α7nAChR在神经元、小胶质细胞及星形胶质细胞均有表达,RIPost增强心肺复苏后大鼠α7nAChR的表达,同时减少了活化的小胶质细胞标志物 CD11b和星形胶质细胞标志物GFAP表达;RIPost增加血浆及脑组织中Ach表达量。 结论:RIPost影响了心肺复苏后大鼠Ach和α7nAChR表达,抑制了小胶质细胞的活化和星形胶质细胞的增殖,其脑保护作用可能与激活胆碱能抗炎通路有关。 实验三α7nAChR在 RIPost减轻心肺复苏后脑损伤炎症反应中的作用 目的:研究α7nAChR在RIPost减轻心肺复苏后脑损伤炎症反应中的作用,观察阻断此受体后对NF-κB和JAK2/STAT3通路的影响。 方法:雄性SD大鼠46只,随机分5组:假手术组(sham, n=6)、模型组(CA, n=10)、远隔缺血后处理组(RIPost, n=10)、远隔缺血后处理+甲基牛扁亭碱组(RIPost+MLA, n=10)、甲基牛扁亭碱组(MLA, n=10)。sham组气管插管及动静脉置管,CA组窒息8min后复苏,RIPost组在ROSC后即刻及3h以止血带对右下肢各行3个循环的结扎与开放;MLA组在复苏即刻腹腔注射MLA。ELISA法检测ROSC24h血清NSE及脑组织炎性因子浓度,western blot法及免疫荧光染色检测 ROSC24h脑组织NF-κB、pNF-κB、STAT3及pSTAT3表达,TUNEL染色检测神经元凋亡。 结果:RIPost后血清NSE及脑组织炎性因子浓度降低,凋亡细胞数减少,NF-κB磷酸化程度降低而转录因子STAT3磷酸化程度增高;给予MLA腹腔注射后,血清NSE及脑组织炎性因子浓度升高,凋亡细胞数增加,pNF-κB含量增加而pSTAT3含量降低。