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一、研究目的骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells-MSCs)作为一种具有多向分化潜能的成体干细胞,相对胚胎干细胞而言,因其来源易得,取材方便,增殖能力强,可在体外大规模扩增而不丢失多向分化潜能,免疫原性弱、免疫耐受性强、免疫排斥反应低,在体内外特定的诱导条件下可以分化为骨、软骨、脂肪、肌肉、神经、肌腱、韧带等多种组织的特点,已成为近年来组织工程种子细胞来源的热点细胞。如何通过各种方法增强MSCs的增殖活力和定向分化能力以满足临床需要是当前亟待解决的问题。从中药中提取小分子化合物调控干细胞的命运已受到科学家格外的青睐,小分子化合物能调控干细胞命运包括增殖、分化、凋亡等多个生物过程,在肿瘤、退行性疾病等领域有广阔的应用前景。本实验小组长期致力于补肾中药龟板的研究,前期研究也表明,龟板中有机小分子化合物甾醇酯能调控MSC增殖。通过构建大鼠Id1启动子证实了补益中药龟板提取物及其活性成分对骨髓间充质干细胞(MSCs)的增殖和分化的影响,并对促使其增殖的分子机制进行了初步的探讨。本实验是在前期研究基础上进一步确定大鼠Id1启动子区域对增殖起决定作用的核心调控区片段并预测可能与调控区相互作用的转录因子,为进一步研究其与补肾中药小分子促进Id1基因表达的关系做准备。强肌健力饮是本实验小组研究的另一补脾为主方药,是临床治疗重症肌无力的经典方剂,前期实验研究中对其活性成分进行了筛选并发现一个新的化合物K9(三环倍半萜),并通过MTT检测结果提示了K9 (三环倍半萜)作为低毒性化合物,可能启动了MSCs的分化。本实验希望进一步确定K9诱导MSCs向软骨分化的作用,同时初步探讨其机理。二、实验方法和内容1、本实验以前期构建的大鼠Id1启动子全长1742bp(-1765／+88)为模板克隆了4个不同长度的Id1启动子片段,将其连接到带有luciferase报告基因的PGL3-basic载体上,测序正确后,用磷酸钙共沉淀法转染MSC,PEI转染其他细胞系,检测Luciferase表达量,Luciferase合成量反映Id1启动子活性的状态。分析获得大鼠Id1启动子区域对转录起决定作用的核心调控区片段(-1765～-1164),采用TRANSFAC数据库分析了这一区域的转录因子结合位点,发现了与增殖相关的核转录因子E2F.采用基因突变技术,将缺失核转录因子E2F的Id1启动子片段作用于MSCs观察Id1启动子活性。2、应用RT-PCR的方法,用不同浓度的K9(三环倍半萜)作用于MSCs不同的时间点,提取RNA检测软骨分化表型相关蛋白及SHH信号通路相关蛋白的变化。三、实验结果1、测转染质粒后luciferase和pRL的酶活性,结果显示,PGL3-Id1不同片段组的luciferase表达量明显高于PGL3-basic组,且转录活性在PGL3-Id1质粒全长组与PGL3-Id1-1片段(-1765～-1164)之间出现了明显减低的现象,同时E2F缺失的PGL3-E2F-17,PGL3-E2F-26的活性相对PGL3-Id1有明显的降低。PGL3-basic组luciferase表达量低于Id1启动子不同片段及PGL3-E2F-17, PGL3-E2F-26,且PGL3-E2F-17,PGL3-E2F-26的活性相对Id1有明显的降低。由此可看出转录因子E2F对于Id1启动子全长活性的影响至关重要,很可能是调控启动子的关键因子。研究初步明确了转录因子E2F对Id1启动子活性的调控作用,为进一步研究和理解Id1启动子在MSC的增殖机制提供新的观点,同时这一结果也为下一步研究特异性调控Id表达的药物奠定基础。2.RT-PCR结果显示,K9处理MSC后相对于对照组的软骨表型相关蛋白SOX9、COIX、Epiphycan 3、6天表达均增强；SHH通路中Ptch与对照组相比,3、6天表达均增强,靶基因Glil六天表达增强。四、结论大鼠Id1启动子(-1765～-1164)片段是核心调控区,核转录因子E2F的缺失对Id1启动子活性有影响,为以Id1启动子为突破点讨论龟板提取物促进MSC增殖机理提供了进一步的依据,也为筛选调控ID1基因表达药物提供了新的方法。K9诱导MSC向软骨分化可能与SHH信号通路有关。