【摘 要】
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刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）是一种专性胞内寄生的顶复亚门原虫,能够感染绝大部分温血动物,因宿主免疫机制抑制作用,多数感染不表现出典型的症状,但在免疫缺陷的宿主中,因虫体的过量增殖则会对宿主细胞和组织造成严重损伤。相关研究显示弓形虫抗原或弓形虫弱毒株对多种肿瘤具有较好的抑制作用,同时,作为肿瘤微环境重要组分的IL-17A也被证明参与宿主对弓形虫的免疫。本论文以IL-17A为研究对
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刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）是一种专性胞内寄生的顶复亚门原虫,能够感染绝大部分温血动物,因宿主免疫机制抑制作用,多数感染不表现出典型的症状,但在免疫缺陷的宿主中,因虫体的过量增殖则会对宿主细胞和组织造成严重损伤。相关研究显示弓形虫抗原或弓形虫弱毒株对多种肿瘤具有较好的抑制作用,同时,作为肿瘤微环境重要组分的IL-17A也被证明参与宿主对弓形虫的免疫。本论文以IL-17A为研究对象,探究IL-17A对弓形虫的入侵和增殖以及对肿瘤细胞恶性表型的影响,为阐明IL-17A介导弓形虫抑制肿瘤细胞的作用机制奠定基础。首先通过原核表达及慢病毒包装构建IL-17A过表达的4T1细胞系分别获得外源性及内源性IL-17A蛋白。体外试验将外源性IL-17A蛋白及弓形虫分别与4T1肿瘤细胞共培养,探究外源性IL-17A及弓形虫对4T1肿瘤细胞增殖的影响。同时,以稳定过表达细胞系分析内源性IL-17A对弓形虫速殖子的入侵增殖能力、噬斑形成能力以及对4T1细胞恶性表型的影响。体内试验通过小鼠模型评估IL-17A对小鼠4T1乳腺皮下移植瘤发生发展的影响,并分析IL-17A介导弓形虫对小鼠4T1乳腺皮下移植瘤发生发展的影响。利用4T1细胞株及稳定过表达细胞株构建小鼠乳腺皮下移植瘤模型,对肿瘤模型小鼠经腹腔接种弓形虫速殖子减毒株及其裂解抗原TLA诱发抗弓形虫免疫,测定不同阶段肿瘤生长数据并绘制生长曲线,并采用H.E.染色法观察肿瘤组织病理变化,最后经RT-q PCR分析小鼠外周血多炎症细胞因子表达情况,评估IL-17A介导弓形虫抑制肿瘤免疫应答能力。试验结果表明:成功克隆出约400 bp大小的IL-17A基因,并表达获得37 k Da大小的IL-17A外源蛋白。慢病毒包装后经嘌呤霉素成功筛选出稳定过表达细胞系p CDH-IL-17A-4T1,经RT-q PCR及westen-blot方法测定过表达效率,结果表明过表达细胞系IL-17A在m RNA和蛋白质层面均上调显著（*p＜0.05）。体外试验方面:通过CCK-8试验测定不同浓度的IL-17A与4T1细胞增殖速率呈正相关,且弓形虫速殖子T.g及其裂解抗原TLA分别与4T1细胞共培养时均表现出抑制4T1细胞增殖。CCK-8试验测定稳定过表达细胞株增殖速率明显高于对照组,Transwell试验观察到稳定株侵袭能力增强,且与对照组差异显著（*p＜0.05）。弓形虫速殖子T.g及其裂解抗原TLA分别与稳定过表达细胞共培养时,稳定过表达细胞株增殖速率均表现减慢。分别以IFA和结晶紫染色法观察速殖子侵染细胞,计算感染细胞所占比例,结果显示过表达IL-17A不同程度地促进弓形虫在细胞中入侵、增殖及噬斑形成,与对照组差异显著（*p＜0.05）。体内试验方面:分别测定并绘制4T1细胞株及稳定过表达细胞株构建的皮下移植瘤生长曲线,表现稳定过表达细胞肿瘤生长缓慢,提示IL-17A对肿瘤发生发展的抑制,与对照组差异极显著（*p＜0.01）。小鼠肿瘤模型试验发现肿瘤发生发展对小鼠外周血的IFN-γ、IL-12、IL-17和TNF-α等细胞因子的相对表达产生影响,其中稳定过表达细胞肿瘤组小鼠外周血中IL-12相对表达量上调显著（*p＜0.05）。通过分析弓形虫减毒株或弓形虫裂解抗原TLA感染后的小鼠皮下移植瘤生长曲线,弓形虫减毒株及其裂解抗原TLA表现出对乳腺肿瘤的抑制效应,且平均抑制率提高30%-50%,尤其对稳定过表达细胞肿瘤抑制率提高至超过50%,提示IL-17A介导弓形虫抑制肿瘤的增强效应。弓形虫感染影响小鼠肿瘤免疫应答,尤其诱导稳定过表达细胞肿瘤小鼠的IL-4、IL-6、IL-10、IL-12、IL-17、IFN-γ和TNF-α等细胞因子相对表达量发生变化,其中以IL-12相对表达量上调最为显著（*p＜0.01）。肿瘤病理组织检查结果显示,稳定过表达细胞肿瘤的瘤体中血管丰度明显较低。弓形虫减毒株或其裂解抗原TLA感染使小鼠肿瘤细胞密度不同程度降低的同时,瘤体血管丰度也降低,尤其弓形虫减毒株与过表达IL-17A对肿瘤的共同作用影响较为显著。综上所述,IL-17A体外可促进肿瘤细胞4T1的增殖与分化,还可促进弓形虫入侵4T1细胞、在4T1细胞中增殖及噬斑形成。IL-17A体内抑制4T1细胞的成瘤效应,抑制肿瘤的发生发展;IL-17A可进一步通过诱导抗弓形虫免疫中IL-12产生级联免疫效应,从而抑制肿瘤发生发展。
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