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禽致病性大肠杆菌（Avian pathogenic Escherichia coli,APEC）是严重危害养禽业健康发展的重要病原菌之一,该病菌可通过侵染呼吸道粘膜上皮引起禽的呼吸系统和全身性疾病。目前,已知定位于鸡呼吸系统的一类亲水性膜表面糖蛋白-鸡肺表面活性蛋白A（chicken surfactant protein A,cSP-A）具有抗病原微生物的天然免疫功能,是防御病原菌入侵的第一道防线。该蛋白分为鸡肺表面活性蛋白A1（chicken surfactant protein A 1,cSP-A1,也称鸡肺凝集素）和鸡肺表面活性蛋白A2（chicken surfactant protein A2,cSP-A2,旧称鸡肺表面活性蛋白A）。由于天然cSP-A提取纯化过程繁琐且费用昂贵,妨碍了cSP-A抗病原菌的研究。因此,采用基因工程技术制备重组cSP-A1及cSP-A2,开展其抗APEC的机制研究显得尤为重要。本研究通过建立SPF雏鸡APEC肺部感染模型,探明APEC感染初期雏鸡呼吸系统cSP-A1和cSP-A2的表达情况;利用昆虫杆状病毒表达系统及哺乳动物细胞表达系统分别制备cSP-A1和cSP-A2重组蛋白;体外开展cSP-A1和cSP-A2重组蛋白抗APEC及其他细菌的活性研究。1、SPF雏鸡肺部感染APEC初期cSP-A1和cSP-A2的表达变化取5日龄SPF鸡经气管注射1×10~6CFU/m L的APEC（100μL/只）,对照组注射等量无菌PBS,然后分别于感染后12小时（hours post-infection,hpi）和1、2、3天（days post-infection,dpi）进行临床观察和大体剖检,并采集气管和肺组织进行组织病理学观察和组织载菌量测定,以及应用实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantification PCR,q RT-PCR）和多重荧光免疫组织化学染色（multiplex fluorescence immunohistochemical staining,m IHC）对cSP-A1和cSP-A2进行定量和定位,并选择2 dpi的肺组织进行转录组RNA测序进一步验证。大体剖检和组织病理学观察结果表明雏鸡APEC肺部感染模型成立;q RT-PCR和m IHC检测结果发现感染组气管上段和肺组织（L3及L4区域）cSP-A1和cSP-A2在2 dpi表达均上调,且其结果与肺转录组RNA测序结果一致;组织载菌量显示,感染组肺脏载菌量1dpi最高,随后2d逐渐下降。2、利用昆虫杆状病毒表达系统制备cSP-A1和cSP-A2重组蛋白利用Overlap PCR技术在cSP-A1和cSP-A2基因N端分别引入Gp64信号肽序列,分别连至p Fastbac1转移载体中,构建p Fastbac-cSP-A1和p Fastbac-cSP-A2转移载体,然后转化DH10Bac感受态细胞,通过蓝白斑筛选,提取Bacmid-cSP-A1和Bacmid-cSP-A2重组杆粒并转染sf9细胞,获得重组杆状病毒r Bv-cSP-A1和r Bv-cSP-A2。经间接免疫荧光（indirect immunofluorescence,IFA）及Western blot分析表明,cSP-A1和cSP-A2重组蛋白可以在sf9细胞中表达,并且主要以可溶性蛋白形式分泌至培养基上清中。采用Ni2+柱亲和层析方法纯化蛋白,获得的cSP-A1重组蛋白大小为25 k Da（单体）,产量为11 mg/L;cSP-A2重组蛋白大小为60 k Da（二聚体）,产量为7 mg/L。3、利用哺乳动物细胞表达系统制备cSP-A1和cSP-A2重组蛋白PCR扩增cSP-A1和cSP-A2目的基因,分别连至p KMD-CMV真核表达载体中,构建p KMD-cSP-A1和p KMD-cSP-A2重组表达载体,大提质粒,然后分别瞬时转染293F细胞。经IFA及Western blot分析表明,cSP-A1和cSP-A2重组蛋白可以在293F细胞中表达,并且主要以可溶性蛋白形式分泌至培养基上清中。采用Ni2+柱亲和层析方法纯化蛋白,获得的cSP-A1重组蛋白大小包含25 k Da（单体）和50k Da（二聚体）,产量为9 mg/L;cSP-A2重组蛋白大小为30 k Da（单体）,产量为6 mg/L。4、cSP-A1和cSP-A2体外抗APEC及其他细菌的活性研究采用细菌凝集试验、菌落计数法以及测定细菌细胞膜通透性研究重组cSP-A1和cSP-A2对APEC及其他细菌生长和活力的影响。细菌凝集试验和菌落计数法结果显示,100μg/m L重组cSP-A1和cSP-A2对APEC（AE17及AE81）、金黄色葡萄球菌（ATCC 25923）、鸡白痢沙门氏菌（ATCC 10398）、肠炎肠道沙门氏菌（ATCC13076）、甲型副伤寒沙门氏菌（ATCC 9150）和大肠埃希氏菌（CMCC 44102）等菌株均有凝集和抑制作用,但相同含量293F表达的重组蛋白凝集活性均高于sf9表达的重组蛋白。通过测定APEC AE17细胞膜的通透性进一步发现,重组cSP-A1和cSP-A2的凝集作用还可导致APEC细胞膜受损。综上所述,本研究通过建立APEC肺部感染模型,发现雏鸡肺部感染APEC初期（2 dpi）cSP-A1和cSP-A2的表达呈现共上调;利用昆虫杆状病毒表达系统及哺乳动物细胞表达系统分别获得相应产量的cSP-A1和cSP-A2重组蛋白;100μg/m L重组cSP-A1和cSP-A2对APEC AE17及其他多种细菌均具有一定的凝集和抑制作用,并损伤APEC AE17的细胞膜。