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禽致病性大肠杆菌（Avian pathogenic Escherichia coli,APEC）是一种典型的肠道外致病菌,在禽类中具有广泛的宿主谱,不仅是严重危害养禽业健康发展的重要病原菌,而且是人类肠外致病性大肠杆菌毒力基因的潜在储库,由于APEC血清型复杂多样,毒力基因簇突变率高,其防治仍存在诸多困难。因此,开展APEC致病机制的研究,对养禽业的发展和公共健康安全都具有重要意义。大肠杆菌Ⅲ型分泌系统2（Escherichia coli Type III Secretion System 2,ETT2）存在于大多数大肠杆菌基因组中,参与细菌一系列致病过程。在此过程中,伴侣蛋白能够调控效应蛋白的分泌,在其致病性方面发挥至关重要的作用。Yge G作为ETT2潜在的伴侣蛋白,目前仅在ETT2基因簇部分缺失的大肠杆菌中有初步研究,发现其对细菌的致病性有一定的影响。迄今为止,尚未见对含有完整ETT2基因簇的APEC中yge G调控功能的研究,并且对伴侣蛋白Yge G结构和功能的预测也缺少一定的证实,所以该基因具有十分重要的研究价值和科学意义。本研究利用Red同源重组技术构建ETT2潜在伴侣蛋白基因yge G缺失株和回复株,并进行生物学特性分析;通过细胞试验和动物试验,探究yge G对APEC在感染宿主细胞和雏鸡体内定殖中发挥的作用;构建Yge G原核表达载体,表达该蛋白并验证,通过GST pull-down联合质谱初步筛选Yge G互作蛋白。主要的研究内容和结果总结如下:1.禽致病性大肠杆菌yge G缺失株和回复株构建及对生物学特性的影响以实验室保存的含有完整ETT2基因簇的菌株APEC81为研究对象,利用Red同源重组技术构建APEC81-Δyge G缺失株,使用低拷贝质粒p STV28构建APEC81-CΔyge G回复株。通过生长特性、运动性、生物被膜形成能力、环境耐受力等试验分析yge G对APEC生物学特性的影响。生长曲线测定结果表明,缺失株APEC81-Δyge G生长特性无显著变化（P＞0.05）;生物被膜试验结果表明,缺失株APEC81-Δyge G生物被膜形成能力显著降低（P＜0.01）;运动性试验结果显示,缺失株APEC81-Δyge G运动能力极显著升高（P＜0.001）;环境耐受力试验结果表明,缺失株APEC81-Δyge G的耐酸和耐氧化应激的能力极显著降低（P＜0.001）,对碱、渗透压和热休克的耐受力显著降低（P＜0.01）。上述试验结果表明,yge G参与调控APEC致病性相关的生物表型。2.ETT2伴侣蛋白基因yge G对禽致病性大肠杆菌致病作用的影响通过细菌溶血性试验、抗血清杀菌试验、细胞黏附侵袭试验、细胞炎性因子检测及制备雏鸡病理组织切片等,探究yge G对APEC致病作用的影响。细菌溶血性试验结果显示,缺失株APEC81-Δyge G溶血状态与野生株相比无显著变化（P＞0.05）;抗血清杀菌试验结果显示,yge G缺失能显著降低其抗血清杀菌作用（P＜0.01）,且当血清浓度为30%和100%时,抗血清杀菌作用极显著（P＜0.001）;细胞黏附侵袭试验结果显示,缺失株APEC81-Δyge G对鸡气管粘膜上皮细胞的黏附能力极显著下降（P＜0.001）,侵袭能力显著增强（P＜0.01）;细胞炎性因子检测结果显示,缺失株APEC81-Δyge G感染细胞后,TNF-α、IL-1β的转录水平极显著升高（P＜0.001）,IL-6转录水平显著升高（P＜0.01）,IFN-γ转录水平升高（P＜0.05）。野生株APEC81、缺失株APEC81-Δyge G和回复株APEC81-CΔyge G分别感染雏鸡后,病理组织切片结果显示,与对照组相比,雏鸡组织器官均出现不同程度的病理变化,在APEC81感染组中,气管受损,粘膜脱落,心肌纤维部分断裂成波纹状且纤维间隙增大,肝细胞肿大且有炎性细胞聚集,APEC81-Δyge G缺失株和APEC81-CΔyge G回复株感染后也存在一定的病理特征,但相较于APEC81感染组来说,程度较轻。上述试验结果进一步表明,yge G参与调控APEC的致病作用。3.Yge G原核蛋白表达及互作蛋白的初步筛选构建原核表达载体p GEX-6P-1-Yge G,转化至大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）中进行IPTG诱导表达并优化其表达条件。Yge G重组蛋白大小约为44 ku,在大肠杆菌BL21（DE3）中高效表达,主要以可溶性蛋白的形式存在,具有良好的免疫原性和反应原性。SDS-PAGE及Western Blot鉴定结果显示,最佳表达条件为:IPTG终浓度为0.25 mmol/L,16℃诱导16 h。以纯化Yge G为诱饵蛋白,APEC81全菌蛋白为猎物蛋白,通过GST pull-down联合质谱初步筛选出1115个与Yge G具有潜在相互作用的蛋白。该互作蛋白库对解析伴侣蛋白Yge G的功能具有重要意义。综上所述,本试验构建了缺失株APEC81-Δyge G和回复株APEC81-CΔyge G,yge G缺失后,APEC81的生长性能和溶血能力无显著变化,生物被膜形成能力、环境耐受能力、抗血清杀菌能力和细胞黏附能力显著降低,运动能力、细胞侵袭能力显著升高,yge G影响生物被膜、鞭毛、细胞炎性因子等基因的转录水平,影响雏鸡气管、心脏、肝脏等组织的病理变化程度,表明yge G参与调控APEC生物表型和致病作用。表达纯化Yge G蛋白并通过GST pull-down联合质谱技术成功得到Yge G候选互作蛋白库。本研究明确了yge G基因的生物学功能,初步探索其可能的互作蛋白,为后期寻找其作用靶点和ETT2分泌蛋白提供研究基础与支撑。