禽腺病毒（Fowl Adenovirus,FAdV）按照科、属的划分,可以将其归类于腺病毒科（Adenovirus family）、腺病毒属成员。此外对病毒血清型进行分析,可以将 FAdV 分为 12 个型（1-7,8a,8b 及 9-11）与 5 个种（A,B,C,D,E）。FAdV感染引起的主要临床症状,如包涵体肝炎、心包积液等,而引起禽类肝炎-心包积液综合症（Hepatitis-Pericardial effusion syndrome）的主要病原是禽腺病毒4型（Fowl Adenovirus-4,FAdV-4）。FAdV-4对外界环境具有很强的抵抗力,不仅能通过种蛋垂直传播给子代,还能通过污染的粪便、水槽以及种蛋进行水平传播,死亡率可高达80%,对国内养鸡业造成了直接经济损失,并阻滞其发展。因此,研发针对FAdV-4的疫苗及病毒快速诊断检测试剂盒将对FAdV-4的早期诊断及预防具有重要作用。本研究通过蛋白原核表达及细胞融合技术,将制备得到的FAdV-4（AH18株）Fiber-1蛋白经纯化及复性后免疫7-8周龄的雌性Bal b/c小鼠,经细胞融合及细胞亚克隆,最终经筛选得到1株能够稳定、特异性地分泌针对FAdV-4的病毒纤突蛋白1（Fiber-1）的杂交瘤细胞并成功筛选出其抗原表位,位于Fiber-1蛋白氨基酸序列第3 5-57位,并基于Fiber-1蛋白建立了具有针对性、准确性的检测FAdV-4的间接ELISA检测方法,具有良好的抗体检出性。以上研究可为多肽疫苗的研发、商品化检测试剂盒的研制以及相关试验提供生物材料。本研究所开展内容如下:1、禽腺病毒4型Fiber-1蛋白单克隆抗体制备及其特性的研究为获得可特异性针对FAdV-4 Fiber-1蛋白的单克隆抗体,对FAdV-4（AH18株）的Fiber-1基因进行扩增并构建原核表达载体,经蛋白原核表达,将获得的Fiber-1蛋白经纯化、复性后免疫7-8周龄的雌性Bal b/c小鼠,经细胞融合及细胞亚克隆,将制备得到的Fiber-1蛋白作为包被抗原,通过间接ELISA方法最终成功筛选得到1株能够稳定分泌抗FAdV-4型Fiber-1蛋白且特应性良好的单克隆抗体的杂交瘤细胞株,随后制备腹水抗体。建立基于Fiber-1重组蛋白的具有特异性的间接ELISA方法,并通过此间接ELISA方法测得该单克隆抗体效价可达1:102400以上。经抗体亚型鉴定试剂盒鉴定得出其抗体的重链为IgG1,轻链为κ链。将FAdV-4接种于LMH细胞后搜集细胞样品作为抗原,制备得到的单克隆抗体作为一抗,进行Western Blot检测,结果显示条带大小正确,说明其能够与FAdV-4样品发生反应,具有良好的反应原性。利用Western Blot对抗体的特异性进行检测,检测结果表明该株单克隆抗体仅与FAdV-4的Fiber-1蛋白反应,而与该病毒的其他蛋白或其他病毒均不反应,说明其特异性良好。2、制备单克隆抗体的功能应用研究对本研究制备得到的单克隆抗体进行功能应用验证。结果表明,制备得到的单克隆抗体在FAdV-4感染LMH细胞过程中具有病毒中和能力,且可以通过间接免疫荧光检测出感染LMH细胞的FAdV-4。在免疫共沉淀实验中还发现该单克隆抗体对Fiber-1蛋白具有良好的免疫沉淀作用。此外,对该单克隆抗体进一步验证还发现,该单克隆抗体可用于免疫组织化学试验来检测FAdV-4。通过成功制备得到的抗FAdV-4 Fiber-1蛋白的单克隆抗体,将为FAdV-4快速诊断试剂盒的成功研制提供可靠的生物材料,亦可为探究Fiber-1蛋白在FAdV-4的致病机制中所发挥的作用提供重要的理论基础。3、Fiber-1蛋白的单克隆抗体的抗原表位筛选及保守性分析经Protean软件分析Fiber-1蛋白,对其进行抗原表位预测。以PCR扩增Fiber-1基因的截短片段,并连接入pCAGGS-HA真核表达载体,转染HEK-293T细胞,真核表达截短蛋白,裂解细胞,并鉴定截短蛋白与制备得到的单克隆抗体的反应原性,确定其识别表位氨基酸序列。将该抗原表位氨基酸序列与NCBI其它11株与FAdV-4相关的Fiber-1蛋白氨基酸序列进行序列比对,发现本研究鉴定的FAdV-4 Fiber-1蛋白抗原表位高度保守,进一步说明了制备得到的单克隆抗体所识别的Fiber-1蛋白的抗原表位对FAdV-4具有特异性,为Fiber-1蛋白结构与功能的研究奠定了基础。